一个遗传性纤溶酶原缺陷症家系的表型与基因突变分析

夏虹，张海月，刘媚娜，李小龙，杨丽红，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

遗传性纤溶酶原缺陷症是由纤溶酶原（plasminogen，PLG）水平降低引起的全身性疾病。该疾病目前分为2种类型，I型缺陷症患者PLG抗原和活性同步降低，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病；II型缺陷症患者PLG抗原水平正常但活性降低，一般呈常染色体显性或不完全显性遗传[1-2]。本研究通过对1例PLG缺陷症患者的家系进行实验室表型与基因突变检测，初步探讨其发病的分子遗传学机制。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者，女，23岁，汉族，怀孕1月余，因既往不明原因胎停2次，于温州医科大学附属第一医院门诊要求相关检查。患者自述既往月经规律，无血栓史，无其他明显出血症状，无长期服用药物史，无肝肾功能异常。否认父母近亲结婚及其家系成员血栓出血史，该家系3代共4名成员（见图1）。收集本院100 名健康对照者的外周血标本做对照，其中男58名，女42名，年龄（35±12）岁，均无肝肾功能异常，无血栓出血史。本研究经本院医学伦理委员会审批，在知情同意的情况下，对上述人员采集血样。

图1 遗传性纤溶酶原缺陷症家系图

1.2 方法

1.2.1 样本采集与处理：采集该家系3代4名成员的外周静脉血2.7 mL，以0.109 mol/L枸橼酸钠1:9抗凝，3 000 r/min离心10 min，取上层贫血小板血浆用于凝血指标检测，下层血细胞用于提取基因组DNA，并进行PCR扩增及测序。

1.2.2 凝血指标检测：凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、纤维蛋白原（fibrinogen， FIB）、蛋白S活性（protein S activity，PS:A）采用凝固法检测；D-二聚体（D-dimer，D-D）、纤维蛋白（原）降解产物（fibrinogen degradation product，FDP）采用免疫比浊法检测；抗凝血酶活性（antithrombin activity，AT:A）、蛋白C活性（protein C activity，PC:A）、纤溶酶原活性（plasminogen activity，PLG:A）采用发色底物法检测。以上指标均在STA-R全自动血凝仪上测定。纤溶酶原抗原（plasminogen antigen，PLG:Ag）采用酶联免疫吸附法测定。以上所有操作步骤仅遵试剂说明书进行。

1.2.3 DNA提取及PCR扩增：应用非离心柱型基因组DNA提取系统抽提先证者及其家系成员外周血基因组DNA，并用DU800核酸蛋白分析仪检测基因组DNA的纯度和浓度。参照文献[3]设计合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。

1.2.4 DNA测序分析：PCR扩增产物割胶回收送上海桑尼生物工程有限公司进行测序。用Chromas软件将测序所得结果与美国NCBI基因库公布的PLG基因序列（GenBank AY192161.1）进行比对，寻找基因突变位点，反向测序予以确认。其他家系成员在先证者明确基因突变位点后，再进行相应突变位点区域的PCR扩增及测序。

1.2.5 生物信息学技术分析：应用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析；利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和Mutation Taster 4 个生物信息学软件在线分析突变氨基酸对蛋白质功能的影响，参考范围及解释如下：Poly-Phen-2：0～1，评分越接近1，有害突变可能性越大；PROVEAN：分数≤-2.5（有害的），＞-2.5（中性的）；SIFT：0～1，≤0.05表明有害突变，＞0.05表明良性突变；MutationTaster：0～1，分数越接近1，该变异对蛋白序列的影响越“有害”；运用Swiss-Pdb Viewer 4.1.0软件，基于已知的PLG结构模型，对突变的蛋白建模进行比对分析。

2 结果

2.1 实验室表型检测结果 先证者及其家系成员PT、APTT、TT、FIB、D-D、FDP、PLG:Ag、AT:A、PC:A和PS:A基本在正常范围内，其母亲PLG:A正常；先证者和其祖父、父亲PLG:A均降低为正常值的50%左右，初步认为3人均属于PLG:Ag水平正常但活性水平低的II型缺陷症患者，见表1。

2.2 DNA测序结果 基因测序发现先证者第15号外显子编码第601位氨基酸的碱基发生c.1858G＞A杂合错义突变，导致丙氨酸转为苏氨酸（Ala601Thr），见图2；其祖父和父亲具有同样的基因突变，均为c.1858G＞A杂合错义突变，家系成员基因型检测结果见图1和表1。

表1 先证者及其家系成员凝血指标及基因突变检测结果

图2 PLG 基因测序结果

2.3 生物信息学技术分析结果

2.3.1 同源序列保守性分析结果：人类PLG基因与NCBI数据库中提供的其他10个同源物种的氨基酸序列进行多重比对，结果显示Ala601在这11个物种间高度保守，见图3。

2.3.2 突变对蛋白影响力评估：4 个在线生物信息学软件PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和Mutation Taster分析PLG基因错义突变p.Ala601Thr对蛋白的影响程度，通过评分进行功能预测，4个软件预测结果保持一致。PolyPhen-2评分结果为0.989分，预示此突变很可能是有害突变；PROVEAN评分结果为-2.774分，预示此突变是有害的；SIFT评分结果为0分，预示此突变可影响蛋白质的功能；Mutation Taster评分结果为0.999分，预示此突变可引起相应疾病。

图3 PLG 基因同源物种多重序列比对结果

2.3.3 蛋白质模型分析结果：在野生型PLG蛋白中，Ala601可与相邻的Thr600形成2个氢键，与Cys604形成1个氢键（见图4A）；当Ala601突变为Thr601时，Thr601分子的侧链变长，空间结构模型分析显示其延长的侧链与空间折叠的Asp646形成2个氢键，并与His603形成1个氢键，见图4B。突变前后的氨基酸氢键发生变化。

3 讨论

编码PLG的基因位于人类第6号染色体长臂6q26- 6q27位置，长52.5 kb，包含18个内含子和19个外显子，共编码791个氨基酸[4]。关于遗传性纤溶酶原缺陷症分子发病机制的研究目前仍较少，截至到2018年3月为止，国内外文献已报道了约75种与PLG缺陷有关的基因突变。该病例研究在国内较为罕见，在我国报道过的该类遗传性疾病仅有1例[3]。

图4 Ala601Thr突变蛋白质模型分析图

本研究对一个遗传性纤溶酶原缺陷症的罕见病例家系进行研究，发现PLG基因第15号外显子存在c.1858G＞A杂合错义突变，导致p.Ala601Thr。该家系的先证者是一名23 岁已婚中国女性，因既往不明原因胎停2次，经生殖中心做试管婴儿，孕1个月余，特于门诊要求相关检查。检查结果显示其PLG:A降低，PLG:Ag水平正常；基因分析发现其为Ala601Thr突变杂合子。对其家系成员进行检查，发现其祖父和父亲PLG:A均降低为正常值的50%左右，PLG:Ag含量正常；基因测序结果显示祖孙3人均携带Ala601Thr杂合突变。先证者母亲凝血各项指标正常，PLG:A和PLG:Ag水平也均正常，基因测序结果显示为此突变野生型。由于祖孙三代PLG:A降低，而PLG:Ag水平正常，初步认为3人均属于PLG:Ag水平正常但活性水平降低的II型缺陷症患者。其父亲和祖父既往亦无血栓史，符合常染色体不完全显性遗传的方式。

第1 例II型PLG缺陷症导致血栓形成的病例由AOKI等[5]于1978年报道，该先证者自15岁脚部挫伤后，不间断地出现血栓复发的症状16年有余。第1 例I型PLG缺陷症导致血栓复发形成的病例由 LOTTENBERG等[6]于1985年报道，该先证者为一名24岁美国男性，其患有深静脉血栓和肺动脉高压，PLG:Ag的含量和活性均降低为正常值的30%。大家普遍认为这2种PLG缺陷症的类型与血栓复发形成密切相关[7-10]。本研究先证者孕1个月余，既往不明原因停胎2 次，此次受孕，B超显示子宫螺旋动脉的血流阻力指数增高。国外有研究发现，在受精卵成功着床后，子宫螺旋动脉开始被滋养细胞不断侵蚀，进而导致管腔扩大，随之子宫动脉血流阻力进行性降低来满足妊娠时期的血氧供应[11-12]。特别在早孕时期，胚胎的发育依赖于子宫动脉的血流灌注，子宫动脉血流若灌注不足，即可能导致妊娠期高血压、胚胎停育等不良妊娠结局，但是如果异常血流能够在早期得到纠正，妊娠结局会显著改 善[13]。该先证者为II型PLG缺陷症，前2 次早孕时期均处于血栓前高凝状态，子宫螺旋动脉的血流阻力指数增高，流速降低，供应胎儿血流减少，营养物质和氧气无法满足胎儿生长发育所需，最终导致胎停发生。此次受孕，积极查找发现复发性流产的原因后，予以抗栓治疗，现已成功保胎亟待分娩。

本研究采用生物信息学技术对p.Ala601Thr突变进行进一步分析。通过同源物种多重序列比对发现Ala601在其11个同源物种间高度保守，说明它是PLG分子一个重要的功能性位点，在PLG蛋白质发挥正常功能中起着相关作用。4个在线生物信息学的预测软件分析都表明此突变为有害突变，在一定程度上能影响蛋白质的功能，并引起相应疾病，这与保守性分析结果一致。当Ala601被Thr601取代时，Thr601侧链与PLG分子的催化活性位点三联体之一的His603形成1个氢键，使His603残基的电荷分布被扰乱，导致异常PLG不能发生与正常催化过程相关的质子转移；Thr601侧链还与PLG分子的另一个催化活性位点Asp646形成2个氢键，电荷分布的变化，导致此活性位点的正常折叠受到立体位阻的影响，空间构象发生变化[14]。突变形成的结构及功能异常的蛋白质，其催化活性位点His603侧链与Asp646侧链的性质改变，导致酶活性丧失，是此家系成员PLG活性水平降低的主要原因。

综上所述，本研究通过对一个II型遗传性PLG缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析，并运用生物信息学技术对其突变基因进行研究，发现先证者家系为国内已报道过的错义突变p.Ala601Thr 杂合子，而先证者复发性流产的原因可能与此突变引起的PLG活性降低继而导致的子宫动脉血流阻力增加有关。