第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶活性和微生物量的影响

王趁义, 陈仙仙, 黄兆玮, 付佳佳, 汪少奇

(1.浙江万里学院, 生物与环境学院, 浙江 宁波 315100; 2.宁波晟乾环境技术开发有限公司, 浙江 宁波 315100)

土壤微生物是土壤生态系统的重要组分之一，几乎所有的土壤物理、化学和生物学性质都直接或间接地与土壤微生物有关，土壤微生物参数变化将有可能成为土壤生态系统变化的预警及敏感指标[1]。其中的细菌、真菌和放线菌不仅是土壤有机物质转化的执行者，又是植物营养元素的活性库[2]。因此土壤微生物在有机质转化、养分循环、肥力形成、污染物降解以及能量流动方面具有重要的作用[3-5]。另外由于微生物生长繁殖的最适温度、湿度及养分条件与植物相似，故可以综合反映土壤肥力和环境质量状况[6]。尿素作为主要的化学氮肥品种，约占氮肥消耗总量60%以上，然而在生产实践中我国水稻、玉米、小麦三大粮食作物氮肥的当季平均利用率仅为33%，远低于美国、欧洲粮食作物的氮肥利用率(分别为50%，65%左右)[7]。主要原因是土壤中的脲酶能将尿素迅速催化水解成NH3，其速率是未经催化水解的1014倍[7]，极大地降低了动植物对氮素的利用，而我国每年因氮肥利用率低下导致的直接经济损失达450亿元[8]。尿素的快速分解，不仅造成农业资源的严重浪费，同时也会引起一系列的生态环境问题[8-9]，如导致植物“烧苗”[10]；引起严重的环境氮污染和农村面源污染[11]；加速土壤酸化、耕地板结的进程[12]；造成大气污染，比如温室效应[13]，臭氧层破坏[14]等。因此，如何在保障土壤供肥能力的同时，提高氮肥利用率，减少氮肥引起的环境污染和生态效应，已成为一个世界性研究课题[8,15-16]。脲酶活性的抑制剂调控技术已成为提高尿素利用率最有效的生物化学方法。但现有的3类脲酶抑制剂中，金属盐类毒性较大；有机类的则因高残留、有耐药性、有效抑制时间短等原因，难以被大范围推广应用；而植物源类抑制剂有效成分小、药效慢、植物的采集具有季节性等缺点不易为农民接受[7]。基于前3类脲酶抑制剂的弊端，目前新型高效绿色的配合物型脲酶抑制剂(以下简称第四类抑制剂)已引起国内外学者的广泛关注[8]，尤其是Schiff碱配合物型，因其结构中N原子上含有孤对电子，毒性小，与金属离子的配位能力较强，可以与多种过渡金属离子形成配合物，表现出优良的抗菌、抗癌、抑制脲酶活性，有望成为一类性能优良的新型脲酶抑制剂[8,17]。但其施加后对土壤环境的影响还鲜有报道，只有在探明其对土壤影响的基础上方可推广应用于大田作物生产或肥料企业。郭晨[18]认为土壤微生物的数量与土壤肥力存在正比例关系，通过测量土壤微生物的多少就能够知道土壤肥力以及肥料、农药或者进入土壤中的外来化学物质对土壤状况的影响，这种方式相较于正常的化学测定方式而言更为便捷与高效。目前，针对第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶活性和土壤微生物生长影响的研究报到极少，仅有的一些研究也只报道了一些传统的脲酶抑制剂如N-丁基硫代磷酰三胺(nBPT)[19]、氢醌(HQ)[20]、腐植酸[21-22]等对土壤微生物类群分布、土壤酶活性及土壤微生物种类和数量的影响。本文的研究结果能为第四类脲酶抑制剂的安全性评价及相关脲酶抑制剂产品的开发与应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

第四类脲酶抑制剂来自项目组前期合成的Schiff碱铜配合物型抑制剂，化学式C14H15N3O6Cu[23]；尿素(N≥46%)购于国药集团有限公司；供试土壤采自宁波市鄞州区首南街道月浦稻田的水稻土，按5点法采取5—20 cm层土样，风干、混匀、研磨，过2 mm筛备用。土壤基本理化性质为：水分含量32.2%，pH值6.7，有机质14.5%，全氮2.26 g/kg，硝态氮0.77 mg/kg，铵态氮3.58 mg/kg，有效磷62.96 mg/kg。

1.2 试验设计

取500 g风干土样于若干个10 cm×14 cm培养容器中，调节土样的含水量至田间持水量的60%，然后置于28 ℃人工气候箱中培养1周以恢复生物活性，并定期搅拌土壤，保持土壤通气性。预培养结束后，将上述土壤分成5组，第1组为空白(K)，第2组仅加入5 g尿素(U)，第3—5组分别加入尿素和尿素量的0.1%，0.5%和1%的第四脲酶抑制剂，所组成的混合物分别记作UI 0.1%，UI 0.5%和UI 1%。各组所加肥料均溶于水之后再施用，每个处理3次重复。然后将上述试验组置于20 ℃的人工气候箱中于4月18号开始培养，4月24号开始取样并且每隔6 d取样测定一次微生物数量和土壤脲酶活性，总共取样7次于5月31号结束，试验期间每天通过称重法加1次水以保持土壤含水量不变。

1.3 测定项目与方法

土壤脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法[24]；土壤微生物的计数采用采用稀释涂平板计数法[25]。称取土样1 g，放入盛有99 ml无菌水的三角瓶中振荡20 min，使土样与水充分混合，制成10-2土壤悬液。用无菌吸管从中吸取1 ml土壤悬液加入盛有9 ml无菌水的试管中充分混匀，以此类推制成10-2，10-3，10-4，10-5等不同稀释度的土壤悬液。然后用无菌吸管各吸取不同稀释度的土壤悬液0.2 ml对号放入已制好的平板培养基中。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基于37 ℃培养箱中培养1 d，稀释梯度选用10-5，10-6，10-7；放线菌采用高氏Ⅰ号培养基于28 ℃培养箱中培养4 d，稀释梯度选用10-3，10-4，10-5；真菌采用虎红琼脂培养基于27 ℃培养箱中培养3 d，稀释梯度选用10-2，10-3，10-4[26]。

1.4 数据统计分析

土壤微生物数量计算公式为：每克土壤样品菌数=某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数。

采用Excel软件进行数据处理，Origin 8.0软件对数据进行绘图，SPSS软件对数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶活性的影响

抑制剂不同施用浓度对脲酶活性的影响如图1所示。由图1可见，尿素表施到土壤后，U，UI 0.1%，UI 0.5%，UI 1%处理土壤脲酶活性逐渐增强，在第12 d土壤脲酶活性达到最大，而空白处理的土壤脲酶活性基本不变，这表明尿素在早期能够被土壤中的脲酶快速分解成碳酸铵。在脲酶抑制剂的作用下，UI 0.1%，UI 0.5%，UI 1%处理组在第12 d，24 d和第36 d土壤脲酶活性受到了显著抑制，其中UI 1%处理的土壤脲酶活性在第12 d，24 d和36 d分别比仅加尿素处理组降低了22.1%，32.2%和40.8%，第36 d UI 1%处理和仅加尿素处理达到显著差异(p<0.05)，说明此类脲酶抑制剂的抑制作用施用后期大于施用前期，这可能与抑制剂本身稳定性有关，由于Schiff碱金属配合物是由Schiff碱配体和金属铜离子配位反应合成的，它的热稳定性会比一般有机物要好一点，因此普通脲酶抑制剂在前期几天就分解完了而第四类脲酶抑制剂在后期还能继续作用，但是具体作用机制有待进一步深入研究。而UI 0.5%和UI 0.1%处理对土壤脲酶活性的抑制率低于UI 1%处理，这表明了当抑制剂的浓度配比达到了1%时，对土壤脲酶活性抑制效果最好。U，UI 0.1%，UI 0.5%，UI 1%的土壤脲酶活性在第12 d之后开始下降并在第42 d之后基本一致，表明了第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶活性的抑制时效性达42 d。

2.2 第四类脲酶抑制剂对土壤细菌数量的影响

第四类脲酶抑制剂对土壤细菌数量的影响如图2所示。5个处理组的土壤细菌数在培养第6 d时差别不大(2.00×107)，第6 d之后都有不同程度的增加，其中UI 1%和UI 0.5%处理组较仅加尿素处理增加的幅度较大，而UI 0.1%处理与仅加尿素处理的细菌数差别不大。12 d之后UI 0.1%和UI 0.5%处理组的土壤细菌增长数量基本一致。各处理的土壤细菌数在第24 d达到最大，之后逐渐减少并在第42 d达到与空白组细菌一样的数量。在整个培养期间，空白组细菌一直处于较低水平。仅加尿素处理的土壤细菌数比空白处理土壤的细菌数多，表明了尿素对土壤细菌生长有促进作用，最大增长率为63.6%。与空白处理组细菌数量相比得出的第四类脲酶抑制剂处理组细菌增长率明显超过了仅加尿素处理组，其最大增长率为86.2%，这主要与以下两个原因有关，一个原因是脲酶抑制剂可以减少尿素水解产生的高浓度氨和铵对细菌生长的胁迫作用，另外能够保证后期有足够的碳源和氮源供细菌生长[27-28]。另一个原因是脲酶抑制剂的加入使细菌生长环境发生了变化(pH值升高、渗透压增加、脲酶活性降低等)，给细菌提供了一个良好的生长环境。UI 0.1%和UI 0.5%处理的土壤细菌数量趋向一致，明显低于UI 1%处理的土壤细菌数量，对比图1与相应浓度处理的土壤脲酶活性差距相一致，因此可以得出这可能与抑制抑制土壤脲酶活性强弱有关。在培养第42 d时，各处理的土壤细菌数达到一致，说明尿素已全部水解，不再为细菌生长提供碳源和氮源。

图2 第四类脲酶抑制剂对土壤细菌数量的影响

2.3 第四类脲酶抑制剂对土壤放线菌数量的影响

第四类脲酶抑制剂对土壤放线菌数量的影响如图3所示，各处理的土壤放线菌数量变化规律大致相同，先上升后下降最后趋于平稳。土壤放线菌数量在第18 d达到最高值，在第30 d趋于平稳。在第42 d，施用脲酶抑制剂处理组的放线菌数量与仅加尿素处理组放线菌数量趋向一致，而空白组的放线菌数量远高于其它4个处理组的放线菌数量。空白组的放线菌数量在整个培养期间要远高于仅加尿素处理组的放线菌数量，这说明尿素对放线菌的生长有抑制作用，最大抑制率达46.4%。3种加了第四类脲酶抑制剂的处理组放线菌数量要高于仅加尿素组放线菌的数量，其中在第12 d和第18 d，UI 0.5%，UI 1%处理组和仅加尿素组达到显著差异(p<0.05)，说明第四类脲酶抑制剂对放线菌的生长有显著促进作用。

图3 第四类脲酶抑制剂对土壤放线菌数量的影响

2.4 第四类脲酶抑制剂对土壤真菌数量的影响

第四类脲酶抑制剂对土壤真菌数量的影响如图4所示，在整个培养期间，UI 1%处理组真菌的数量要高于其它4个处理组真菌的数量。UI 1%处理组真菌的数量在第6 d后有一个较大幅度的升高，而其它4个处理组的真菌数量在第18 d后才有一个较大幅度的增长。各个处理组的真菌数量在第24 d达到生长高峰期，之后开始下降，其中U，UI 0.1%，UI 0.5%处理组真菌数量在第42 d与空白组真菌数量趋向一致。仅加尿素处理组的真菌数量比其它几组真菌数量要低，表明尿素抑制了土壤真菌的生长，最大抑制率达89.7%。UI 0.1%和仅加尿素处理组的真菌数量基本相同，说明低浓度的抑制剂对土壤真菌生长没有太大的影响，当抑制剂浓度继续增大，土壤真菌数量相较于仅加尿素处理组有一个较大的增长，UI 0.5%处理组最大增长率为46.9%，UI 1%处理组最大增长率为83.6%，由此说明第四类脲酶抑制剂的加入能够促进土壤真菌的生长。在第42 d，U，UI 0.1%，UI 0.5%处理组和空白处理组的土壤真菌增长率趋向一致说明尿素已基本水解完全，UI 1%处理组真菌的数量在第42 d有一个小幅度的增长，说明高浓度的第四类脲酶抑制剂抑制土壤脲酶活性时效性比较长，能延长对土壤真菌的影响。

图4 第四类脲酶抑制剂对土壤真菌数量的影响

3 讨 论

土壤脲酶活性受到诸多因素的影响，与基质浓度、温度、pH值、有机质含量等因素相关，在一定时间内可被脲酶抑制剂所抑制[29-30]。研究表明，施加第四类脲酶抑制剂处理的抑制效果都是随施用时间的延长而增强，抑制活性在第36 d达到最强，施入的后期作用大于前期，这与其它类别的脲酶抑制剂的研究结果不一致。赵略[31]研究结果表明第二类脲酶抑制剂nBPT的抑制效果随施用时间的延长而减弱，施入的前期作用大于后期，抑制剂对脲酶的抑制活性在抑制剂施入后的第10 d达到最强，这说明与第二类脲酶抑制剂相比，第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶活性抑制的时效性明显延长，这可能是由于第四类抑制剂的两种组合单元(Schiff碱配体、植物生长必需的金属元素)被限制在配合物骨架中，同时拥有了双活性位点的原因，兼具了无机和有机功能基团各自的性质和功能，从而使它作用时间延长，毒性大为降低[32]。然而，这些认知只是停留在理论意义上，尚需进一步地进行试验验证。

土壤脲酶主要来源于土壤当中的一些菌体[33]，第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶的抑制活性随着抑制剂浓度的增大而增强，抑制剂浓度为1%的抑制作用要远高于抑制剂浓度为0.5%和0.1%。土壤脲酶主要来源于土壤中的一些微生物菌体[32]，第四类脲酶抑制剂对土壤脲酶的抑制活性随着抑制剂浓度的增大而增强，抑制剂浓度为1%的抑制作用要远高于抑制剂浓度为0.5%和0.1%。主要原因是由于土壤脲酶为诱导酶，底物浓度对酶活性影响较大。在脲酶蛋白合成过程中，第四类脲酶抑制剂降低了底物对脲酶合成的诱导和促进作用，从而阻碍了酶的活性中心形成[29]。

土壤微生物是土壤生物中最活跃的部分，他们参与土壤的有机质分解、腐殖质合成、养分转化和土壤的发育及形成，既是土壤中营养元素的“源”，又是营养元素的“库”。施肥后，由于肥料在土壤中要分解(有机肥)或溶解(化肥)成更小的分子或离子，就形成了局部高浓度现象，这些短时间内产生的局部高浓度会对土壤微生物产生明显的影响。但土壤3大微生物对尿素的敏感程度不一样，其中土壤放线菌和土壤真菌对尿素比较敏感，尿素会抑制其生长，这可能与尿素水解产生的铵过度累积有关。Arnebrandt等[34]的研究表明，施用氮肥对土壤微生物群落特别是菌根真菌有直接的抑制作用，其机制是抑制酶活力和积累毒性化合物。而细菌相反，尿素可促进其生长，这可能与尿素水解产生的氮源类物质会给细菌生长提供氮源和碳源有关。

在土壤的3大微生物群体中，第四类脲酶抑制剂对土壤放线菌的生长影响作用较小，对土壤真菌的生长影响较大，对土壤细菌的影响最大。有研究表明土壤中细菌数量的增加有利于土壤养分的转化，能为植物的生长提供良好的环境，土壤中放线菌数量的增加不仅能转化土壤有机质，对植物的土传病原菌也起到一定的拮抗作，促进土壤微生物区系向健康方向发展[35]。探讨第四类脲酶抑制剂对土壤微生物的影响，对于实现化肥零增长，发展绿色和生态农业的战略需求具有重要的理论意义和应用价值。

4 结 论

(1) 第四类脲酶抑制剂浓度为1%对土壤脲酶活性的抑制作用远高于抑制剂浓度为0.5%和0.1%，最大抑制率达40.8%，可以实现适度调控的目的。

(2) 尿素对土壤细菌生长有促进作用，最大促进率达83.6%；对真菌和放线菌有抑制作用，最大抑制率分别为89.7%，46.4%。

(3) 第四类脲酶抑制剂能够促进土壤细菌、放线菌和真菌的生长，抑制剂浓度为1%时促进作用最明显。综合不同浓度抑制剂对土壤脲酶抑制活性的强弱，可以得出第四类脲酶抑制剂施用浓度为1%是最佳用量。