应用qRT-PCR方法检测鼠痘病毒在小鼠不同组织中的差异分布

张 君，成温玉，贾怀杰，牛贤云，程国锋，景志忠

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州730046）

鼠痘（mouse pox）又名鼠传染性脱脚病，是由鼠痘病毒（Ectromelia virus，ECTV）感染引起的一种接触性传染病，对实验小鼠和各种啮齿动物可造成严重危害。ECTV属于脊索动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）、正痘病毒属（Orthopoxvirus）。ECTV为dsDNA病毒，呈砖型或卵圆形，在胞浆中复制，是动物病毒中最大的DNA病毒。实验小鼠中BALB/c、DBA/2、DBA2/J和A/J等近交品系对ECTV易感，而C57BL/6、AKR和129等品系对ECTV具有一定抗性。研究显示，在C57BL/6小鼠的14个抗病毒基因中，有2个以上基因在ECTV感染时表达量上调，而在BALB/c小鼠中的表达量下调，这可能是造成它们对ECTV易感性差异的主要原因[1]。1929年，ECTV首次在美国实验鼠中被分离鉴定，随后不同毒株在世界各地被分离获得[2]。其中毒力最强的Moscow株由Sololiv分离，Andrewes1947年报道[3]。Naval株对BALB/c小鼠具有高致死性，而使CD-1小鼠的发病率和死亡率较低[4]。

ECTV在感染小鼠足垫数小时后，能转移到腿窝淋巴结进行复制，之后通过淋巴管转移到血液中，到达脾脏和肝脏，引起坏死性炎症。低剂量ECTV具有感染性，并可在实验小鼠和野生小鼠中持续传播[5-8]。感染ECTV的小鼠前期临床表现为四肢、头部和尾部肿胀、坏死，后期出现脚趾脱落症状。鼠痘分为急性型、慢性型和隐性感染3种类型，其中急性感染中多见肝脏和脾脏的肿胀坏死，在急性发病期存活的小鼠会产生脓疱样皮疹；慢性感染小鼠出现发育迟缓，生产率下降。

最经典的ECTV检测方法是病理组织切片电镜观察和病毒分离相结合，但该方法耗时较长，对试验条件要求比较苛刻，不适合大批量检测。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或免疫组化技术（immunohistochemistry，IHC）是常用的免疫学诊断方法，操作简单，具有较好的实用价值，但重复性差，干扰因素较多，容易出现假阳性[9-11]。常规PCR和荧光定量PCR等分子生物学手段是针对病原体最常用的定性、定量检测方法。本研究基于ECTV主要核蛋白P4b对应的基因片段建立了qRT-PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）方法，可检测ECTV感染小鼠后不同组织中的病毒载量，同时用病理组织切片技术验证该方法的特异性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 毒株和试验动物 6～8周龄SPF级C57BL/6品系小鼠购自兰州大学动物试验中心；ECTV由本实验室分离、鉴定和保存。

1.2 试剂 ExTaq®、DL2000 DNA Marker、SYBR®Premix ExTaqTMⅡ购自大连宝生物公司； DEPC水购自生工生物工程（上海）股份有限公司；病毒基因组提取试剂盒购自Thermo公司；T4 DNA 连接酶购自Promega公司；DNA片段凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Axygen公司。

1.3 引物的合成与标准品的制备 参考GenBank中ECTV的P4b基因序列（GenBank登录号：951664），应用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物序列：5'-GTAGAACGACGCCAGAATA AGATA-3'；下游引物序列：5'-AGAAGATATCA GACGATCCACAATC-3'，扩增片段为189 bp，引物由上海英俊生物工程有限公司合成。采用Thermo病毒基因组提取试剂盒提取感染组织中病毒DNA，以该DNA为模板用常规PCR扩增P4b基因片段序列，克隆至pJET1.2载体，筛选出阳性质粒作为阳性标准品。

1.4 引物特异性、敏感性及可靠性分析 将阳性标准品换算成拷贝数后，进行10倍梯度稀释，分别稀释到107、106、105、104、103、102、101共7个浓度梯度，在20 μL反应体系中分别加入Premix10 μL、10 mol/μL上游引物和下游引物各0.8 μL、模板2 μL、DEPC水6.4 μL，离心混匀后置于PCR仪中进行扩增。扩增条件：98℃预变性5 min；98℃变性10 s，60℃退火40 s、72℃延伸5 min，34个循环后；72℃再延伸10 min，4℃终止反应。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，分析引物的特异性和敏感性。同时以10倍梯度稀释的重组质粒为模板，进行组内和组间重复性试验，各进行3次重复，分析Ct值的标准差和变异系数，评价该方法的重复性和可靠性。

1.5 感染小鼠组织的采集及病毒DNA的提取 以感染小鼠足垫方式，用纯化的ECTV滤液（3×103个PFU/只）注射SPF级C57BL/6小鼠。分别于感染前及感染后d5和d7将小鼠脱颈椎处死，置超净台内无菌解剖并收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及皮肤等组织，装入无RNA酶的1.5 mL EP管中，做好标记。取10只新的无RNA酶EP管，称重，记录其重量，剪取少量组织放入新的EP管中，再次称重和记录。根据净重加入适量PBS缓冲液，用电动研磨器进行彻底研磨后置于-20℃冰箱冷冻，反复冻融3次后，900×g离心5 min，吸取上清200 μL用Thermo病毒基因组试剂盒提取病毒DNA。

1.6 qRT-PCR方法的建立及其标准曲线 反应体系为20 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ（2×）10 μL、上下游引物各0.8 μL、DEPC水6.4μL、模板2 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火 30 s，共40个循环。熔解曲线的过程：95℃ 1 min。从65℃ 开始每5 s 温度升高0.5℃，结束温度为95℃。将阳性标准品换算成拷贝数后，采用10倍梯度稀释方法分别稀释至107、106、105、104、103、102和101共7个浓度梯度，每个梯度做3个重复，在CFX96荧光定量PCR仪中扩增，以DEPC水为模板的反应体系作为阴性对照。

1.7 qRT-PCR检测感染小鼠组织中ECTV载量 将提取的病毒基因组用DEPC水稀释至200 ng/μL，应用建立的qRT-PCR方法对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤中的ECTV载量进行检测。使用Bio-Rad CFX Manager 软件进行数据收集和初步分析，Mirosoft Excel 2016软件进行数据处理，Graphpad Prism 7.02作图分析。

1.8 感染小鼠病理组织切片的观察分析 分别于感染前及感染后d5和d7将小鼠脱颈椎处死，在无菌超净台里解剖，切取适量新鲜肝脏和脾脏，放入4%多聚甲醛中固定。经脱水、透明，浸蜡形成蜡块，切片机切片后，进行HE染色，在显微镜下观察ECTV感染引起的组织病理变化。

2 结果

2.1 ECTV qRT-PCR检测方法的建立

2.1.1 ECTV qRT-PCR检测标准曲线的建立 标准品进行10倍梯度稀释后，采用绝对定量PCR技术对ECTV的P4b基因片段序列进行扩增，结果如图1所示。标准曲线中拷贝数与Ct值呈线性反比关系，回归方程为y=-3.574x+32.740（R2>0.99），扩增效率为90.5%（图1A）。熔解曲线（图1B）呈现单一峰值，峰窄而尖，峰值为80℃±0.5℃，说明引物特异性强。由扩增曲线（图1C）可看出，qRT-PCR可检测到10个拷贝数，敏感度高于普通PCR（图1D）。

2.1.2 重复性试验 分别以不同浓度（107、105、103、101）的标准品为模板进行重复性试验，结果显示组内和组间的变异系数（CV）均小于3%，表明建立的qRT-PCR方法重复性和稳定性良好。

2.2 小鼠不同组织病毒分布的含量检测

2.2.1 肝脏和脾脏病理变化的观察结果 分别于感染后d5和d7收集小鼠肝脏和脾脏组织做病理切片。结果显示，肝脏表现为病毒性肝炎，肝细胞呈大小不等灶状坏死，周围浸润大量单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，病变肝脏细胞存在嗜碱性包涵体；脾脏表现为病毒性脾炎，红髓和白髓界限相对清楚，但是白髓区域缩小，淋巴细胞无结构细颗粒状坏死，脾脏伴有程度不等的淤血，出血。感染ECTV后d7的小鼠肝脏、脾脏病变严重程度高于感染ECTV后d5的病变程度。

2.2.2 ECTV感染小鼠的组织病毒载量检测与分析 以3000个PFU病毒粒子感染时，在感染d5时小鼠皮肤组织中的病毒载量最高，达6.2×108；脾脏、肝脏次之，达105左右；肺脏、肾脏和心脏最低，仅为103左右；在感染d7时，脾脏中的病毒载量变化最大且最高，达2.78×1010；其次为皮肤和肝脏，分别为1.5×109和1.62×106（图3）。结果表明感染d7时小鼠各组织病毒载量均高于感染后d5的病毒载量。

3 讨论

图1 qRT-PCR方法的建立Fig.1 ECTV quantitative RT-PCR

表1 qRT-PCR组内和组间重复性试验Table 1 Intra-assay and inter-assay repeatability test of qRT- PCR

图2 ECTV感染小鼠的肝脏和脾脏病理变化（HE, 400×）Fig. 2 Pathological changes of liver and spleen of miceinfected with ECTV(HE, 400×)

ECTV属于痘病毒科、正痘病毒属，正痘病毒属有一些具有严格宿主限制性但致病性特别强的病原，如天花病毒和ECTV，还有一些致病性弱但能感染不同宿主的病原，如牛痘病毒和痘苗病毒。痘病毒感染时，一般存在4种感染性病毒粒子形式，其中胞内成熟病毒（intracellular mature virus，IMV），只有当细胞裂解时才被释放出来；细胞内囊膜化病毒（intracellular enveloped virus，IEV）是痘病毒的一种中间形式，由IMV通过高尔基体外侧膜以出芽方式产生。细胞相关的囊膜化病毒（cell associated enveloped virus，CEV）主要负责病毒在细胞间的传播。细胞外囊膜化病毒（extracellular enveloped virus，EEV）是病毒在宿主个体间散播的关键病毒粒子形式。痘病毒的这些属性和感染机制决定了其具有易感染，传播快，发病急的特点。在大部分痘病毒感染过程中，皮肤、脾脏和肝脏是机体抗病毒免疫反应的主要器官，也是在病毒复制和增殖过程中出现病理变化的主要部位[12]。因此，本研究重点建立检测ECTV感染小鼠不同组织病毒载量的qRTPCR方法，并分析与组织病理变化间相关性。示，感染后d7，小鼠肝脏和脾脏整体病理变化比d5更严重，证实建立的qRT-PCR方法结果的可靠性和稳定性。

图3 ECTV感染小鼠后不同组织得病毒载量Fig.3 Viral load in different tissues of the mice infected with ECTV

综上所述，本研究成功建立了可快速、特异、高效检测小鼠组织中ECTV载量的qRT-PCR方法，能定性、定量检测ECTV在各组织中的增殖、分布和消长情况，为ECTV致病机理的研究奠定了基础。

组织病理变化和病毒血症是衡量机体致病程度的重要指标，而病毒在组织中的载量是引起机体发病的关键因素。牛痘病毒A4L基因比较保守，能编码一种具有多种生物学特性的核蛋白，同时其同源基因P4b在ECTV中也高度保守，因此将P4b作为候选基因建立了检测ECTV载量的qRT-PCR方法。通过检测阳性重组质粒和感染小鼠不同组织中ECTV的P4b基因序列发现，本研究建立的qRT-PCR方法具有高度的特异性和敏感性，能检测出浓度为10～107copies/μL内的样品，扩增效率达90.0%以上，且可针对ECTV进行特异性快速检测。检测感染小鼠不同组织病毒载量发现，皮肤、脾脏和肝脏中病毒载量最高，心脏和肾脏中较低，说明ECTV主要在皮肤、脾脏和肝脏细胞中大量复制和增殖，并引起不同组织病理变化，这与临床病理解剖变化特征一致。

应用建立的qRT-PCR方法在感染小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤中均可检测到ECTV，但其病毒载量存在明显差异。同时，感染后d7时小鼠组织中病毒载量明显高于d5的病毒载量。ECTV感染小鼠肝脏和脾脏的病理组织切片结果显