乳酸发酵第2 阶段能量释放生物学教学研究

王 希 洪 鲲，2 赵玉丹 杨莹艳 龚记熠，2 乙 引，2*

（1 贵州师范大学生命科学学院 贵州贵阳 550001 2 贵州省植物生理与发育调控重点实验室 贵州贵阳 550001）

0 前言

普通高中课程标准实验教材， 人教版高中生物学必修1《分子与细胞》中关于乳酸发酵的概念叙述： 无论是分解成酒精和二氧化碳或者是转化成乳酸， 乳酸发酵都只有在第1 阶段释放出少量的能量，生成少量ATP［1］。 而能量的形式多样，可以是势能、热能、化学能、电能等，这里的“能量”是否特指生物体可直接利用的能量则表述不清晰。这就可能会使学生在理解该概念时进入误区：乳酸发酵第2 阶段没有除可供生物体生命活动需要的能量之外其他能量的释放。 从已发表的文献研究表明， 乳酸发酵第2 阶段的确没有ATP 产生，但丙酮酸到乳酸的转化过程要能自发进行，需满足ΔGθ＜0，释放能量。

1 乳酸脱氢酶催化下H 的转移

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）主要存在于动物的肌肉中，L-乳酸脱氢酶使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作辅酶（氧化型和还原型分别为NAD+、NADH），可逆催化氧化还原反应，使L-乳酸和丙酮酸相互转化［2］。 李璟等［3］研究中发现乳酸脱氢酶催化的反应为可逆反应，丙酮酸和乳酸既是底物又是产物。 在骨骼肌运动等缺氧环境中，催化反应向释放乳酸的方向进行。Anderson 等［4］证实丙酮酸被NADH 还原为乳酸的反应过程， 是氢原子H 以氢负离子（H--hydride anion）以含有2 个电子的状态可逆地转移到丙酮酸的2-C 位上。 侯若冰等［2］采用量子化学ab initio 计算方法分析频率，表明反应只含一个频率。 这与王镜岩等［5］编著的《生物化学教程》 “在340 nm 波长处还原性NADH 有一个吸收峰，而氧化型NAD+则无”的相关表述一致。 侯若冰等［2］通过对反应物复合物、过渡态及产物复合物的能量进行精确计算，验证结果表明反应的过渡态是H-的转移， 即NAD 的氧化型NAD+是H-的电子接纳体，NADH 是还原途径的电子供体。该反应过程如下：NADH⇌NAD++H-；NADH→2e→NAD+（-0.315 V）。

生物体的代谢中，高能物质NADH 被氧化，提供2 个电子进入电子传递链，同时释放H+，而H+在线粒体基质中可自由移动［6］。

2 H 在复合体Ⅰ中穿梭

复合体Ⅰ（complex Ⅰ）或称NADH-Q 还原酶（NADH-Q reductase）， 含 一 个FMN 辅 基 黄 素 蛋白，L 形；一个臂位于线粒体内膜上，另一个壁伸向线粒体基质。 有氧呼吸和乳酸发酵第1 阶段都在细胞质基质中发生糖酵解反应，1 分子葡萄糖释放2 分子丙酮酸、2 分子NADH。 糖酵解中释放的NADH 不能透过线粒体膜进入线粒体，而细胞中NAD+含量有限， 有氧条件下，NADH 释放的电子最终被电子传递链下游复合体Ⅳ中的分子氧所接收即氧化磷酸化过程［6］。 电子经过电子传递链时，途中经过多个蛋白质复合体。复合体Ⅰ只为电子传递链中的第1 个复合体， 只有经过复合体Ⅳ时电子才能传递到O2，势能足以转化为ATP。 无氧状态下， 糖酵解释放大量的NADH 发生堆积，则NAD+被大量消耗，细胞质基质中NADH／NAD+值远大于线粒体基质中NADH／NAD+值， 此时NADH可通过甘油-3-磷酸穿梭途径和苹果酸-天冬氨酸穿梭等途径进入线粒体内膜，NADH／NAD+回到正常水平，以维持机体NADH／NAD+平衡［5］。

因此，无氧条件下电子传递链中断，电子不能传递到O2，不能产生ATP。

3 无氧条件下的丙酮酸-乳酸发酵

人的骨骼肌在剧烈运动时处于无氧状态下不能进行有氧呼吸， 细胞利用糖酵解释放少量ATP暂时缓解能量不足。 糖酵解释放的NADH 急需被氧化成NAD+，才能使糖酵解途径中的甘油醛-3-磷酸继续被氧化。丙酮酸被乳酸脱氢酶催化，成为NADH 的氢受体，生成乳酸。 反应如下：

4 标准还原势计算乳酸发酵过程自由能变化

根据能斯特（Walther Nernst）方程，任何浓度下还原势和标准还原势的关系如（a）所示：

R为气体常数R=8.315 J／（mol·K），T 为热力学温度，n 为每分子物质转移的电子数，F 为法拉第常数F=96480 J／（V·mol），Eθ为标准还原势。 在25℃的情况下T=298 K，人体或哺乳动物体内释放的生物化学反应都是在pH=7 环境下,标准还原势用E′θ表示，代入（b）中即可计算出E（25℃、pH=7）。 生物体 内 一 些E′θ可 查 询：丙 酮 酸+2H++2e-→乳 酸 的E1′θ=-0.185 V， 丙 酮 酸/乳 酸 的E1′θ=0.185 V；NAD++H++2e-→NADH 的E2′θ=-0.320 V［5］。

根据热力学第二定律标准自由能变化（standard free energy change）ΔGθ=-nFΔE′θ。 当ΔGθ＜0，反应自发进行且释放能量；ΔGθ＞0 时， 反应不能自发进行。 通过计算乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成乳酸时ΔGθ的大小， 即可判断反应中的能量变化。 由NAD+／NADH 的氧化还原电对的E′θ=-0.320 V，丙酮酸／乳酸的氧化还原电对的E′θ=0.185 V，推导出ΔE′θ=-0.135 V，则ΔGθ=-2×［96.5 kJ／（V·mol）］×（0.135 V）=-26.055 kJ／mol，ΔGθ＜0；而在无氧条件下发生糖酵解释放的NADH／NAD+值远远大于标准状态,实际情况下ΔGθ值更小。 因此，该反应可以自发进行,反应过程释放一定能量（ΔGθ=-26.055 kJ／mol),在贾金堂等［7］的研究文献和周海梦等［8］译《生物化学原理》中也得到证实，但是该放能反应无法驱动ATP 的合成。

5 乳酸发酵第2 阶段ATP 的释放研究进展

通过文献综述， 发现明确指出乳酸发酵第2阶段能释放能量的较少， 很多研究者较为关注乳酸发酵机理。 例如胡晓辉等［9］研究表明氧气不足时植物有氧呼吸受到抑制同时启动乳酸发酵，以缓解糖酵解中NAD+的不足。 刘明厚等［10］持相同观点：马铃薯块茎、甜菜块根、胡萝卜叶和玉米胚在进行乳酸发酵时,释放乳酸。 贾金堂等［7］通过研究氧化还原反应中自由能变化提出乳酸发酵第2阶释放能量。 刘学廷等［11］通过比较有氧呼吸和乳酸发酵的异同点，得出乳酸发酵第2 阶段丙酮酸在酶的催化下释放乳酸，释放少量能量。 胡四新［12］通过分析无氧状态下糖酵解释放的2 个NADH 全部参与乳酸发酵第2 阶段反应， 提出该过程没有ATP 的释放。 靳国祯等［13］则持相反观点，乳酸发酵第2 阶段不但没有ATP 的释放，同样没有能量的释放。对此，笔者比较认同乳酸发酵第2 阶段没有ATP 的产生，但NADH 携带的化学能一部分储存到乳酸分子中，另一部分以热能等形式释放。此外，张春晖等［14］在研究苹果酸-乳酸发酵（MLF）时发现第2 阶段的确没有底物水平磷酸化发生，但其后续研究表明, 一些厌氧细菌在无氧状态下可以通过其他途径获得ATP， 该类细菌生长发育所需的能量主要源于L-苹果酸摄入和（或）L-乳酸跨膜流出释放质子电动势（pmf），pmf 驱动F0F1-ATPase 合成ATP。 这表明，虽然MLF 中没有直接产生ATP，但通过相关物质转运间接产生ATP。

综 上 所 述， 乳 酸 发 酵 第 2 阶 段 ΔGθ=-26.055 kJ／mol，ΔGθ＜0，释放一定能量；但不能合成ATP， 反应所释放的能量最终以热能等形式散失，还是用于其他途径，没有在文献中找到相关论证，期待有后继研究。