沼液微生物燃料电池的产电及有机物降解特性研究

王 芳，张德俐，陈 梅，易维明

（山东理工大学农业工程与食品科学学院；山东省清洁能源工程技术研究中心，淄博 255049）

0 引 言

近年来中国大型沼气工程迅速发展，随着沼气工程的急速发展，大量沼液积累。由于发酵沼液仍具有较高浓度的有机质含量，而且成分复杂[1]，如果处理不当，将严重威胁生态环境。目前沼液处理方式主要有 3种，一是还田利用，二是曝气好氧处理，三是生态处理。国外发达国家对沼液的处置方式主要是还田利用，但是对于中国来讲，农村人均耕地较少，种养殖脱节严重，有相当一部分沼气场周围农田很难消纳所产沼液，不得不采用生态处理或曝气好氧方法对沼液进行后处理，以满足环保排放要求[2]，但是这种处理方式，耗能巨大，经济成本高。由于沼液中含有较高化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）、氨氮、抗生素等，如果不加处理直接排放或还田，容易造成环境二次污染。

微生物燃料电池（microbial fuel cell，MFC）可以利用微生物降解可溶解的复杂有机物，获得电能[3]。多种基质已被用于MFC的研究中，包括一些单一基质例如醋酸盐、葡萄糖和一些复合基质等。目前，研究最为广泛的复合基质包括：各类污水及木质纤维素类生物质。例如，啤酒厂废水[4-5]与果汁加工工厂废水等[6]。由于食品工业废水中含有大量有碳水化合物，例如糖类、脂类等，是MFC底物有机质很好的来源，所以此类物质非常适合于作为MFC的阳极底物[7]。

发酵沼液作为有机废水的一种，含有大量的糖类、挥发性脂肪酸及一些腐殖质，可以直接作为MFC中有机物底物来源。此外，沼液中还存在大量营养元素，例如氮、磷、钾等微量元素，也是微生物代谢所必须的[8]。所以发酵沼液也可以作为MFC阳极底物加以利用，不仅可以产生电能，同时可以进一步降解沼液中的有机物质，使其达到减量化、无害化。同时，利用MFC处理发酵沼液废水反应条件温和，不需要能量输入，无污染，反应可连续。本研究针对沼气工程运行情况不同，所产沼液中有机物浓度不同，利用双室MFC，探究了不同有机物浓度对沼液MFC产电性能及有机物去除效果的影响。同时通过对原料及MFC中阳极生物膜和阳极溶液中微生物多样性与菌群结构分析探究MFC对沼液中有机物降解能力及产电的可行性。

1 试验材料与方法

1.1 阳极底物与接种物

试验所用沼液来源于山东理工大学厌氧发酵实验室，将沼气发酵后料液用 4层纱布过滤去掉较大固体残渣，测定过滤后沼液COD质量浓度为（3618.6±55.6）mg/L，含有短链纤维素质量浓度为(882.5±59.2) mg/L，然后利用去离子水将沼液稀释成不同的COD浓度，稀释倍数分别为2倍、4倍、8倍，将其作为MFC反应器的阳极底物。接种物来源为山东理工大学校区内河沟污水，其COD质量浓度为106.6 mg/L。

1.2 MFC构型与操作过程

试验中采用双室构型MFC。由阴极室、阳极室、隔膜等部分构成。反应器上部及两侧分别留有取样孔，以便对反应液采样及阴极通入空气。阴、阳极室分别采用8 cm×8 cm×8 cm正方体有机玻璃反应槽构成，利用硅胶垫及法兰密封连接。中间的隔膜为Nafion117（Du Pont）质子交换膜，Nafion117膜为全氟磺酸聚合物质子交换膜，其厚度为183 μm，电导率为0.083 S/cm，质子交换膜在使用前需进行处理，其处理方法为：在30% H2O2溶液中，温度为80 ℃，浸泡1 h，取出后，于去离子水中浸泡1 h，再在0.5 mol/L的H2SO4中浸泡1 h，在去离子水中清洗3次，每次10 min，最后保存在去离子水中备用[9]。阳极和阴极电极分别用5 cm×5 cm的正方形碳毡为基材，钛丝作为导线制成，两电极间距离为6.5 cm。MFC在正常运行时，两极间接有恒定负载电阻，阻值为1 000 Ω。

在MFC第一周期开始前，向阳极反应器内加入过滤后新鲜沼液与接种物，其中接种物占总体积 35%，并按一定的体积比（5:1）加入金属盐类培养基（MSM）（表1），混合均匀进行MFC启动。在试验过程中，大约15 d左右完成一个产电周期，一个产电周期结束后，排出阳极原混合溶液的 70%，重新添加新鲜沼液。阴极溶液为50 mmol/L的铁氰化钾溶液，MFC运行过程中，每2～3 h向阴极室内通入空气，并保持1 min。反应装置置于环境温度为20 ℃左右的室内运行。

表1 金属盐培养基（MSM）成分[10]Table 1 Composition of metal salt media (MSM)

1.3 试验分析方法

1.3.1 产电特性分析

本试验采用多通道数据采集卡（IN USB-6008，美国）进行电压采集，利用 Labview 数据采集软件对数据进行记录保存，每隔2 min采集1次各路电压值，每隔1 h对30组数据计算平均数，以每1 h获得的平均电压为最终值；极化曲线采用改变外电阻法获得[11]。将MFC反应器外部连接可调变阻箱（ZX21型），外电阻阻值从1×104Ω调至 80 Ω，外电阻每调节一个阻值需要稳定 5 min后，再对电压进行采集。极化曲线线性部分的斜率即为反应器的内阻。

本试验中电流密度由欧姆定律计算。功率密度曲线为功率密度 P 随电流密度的变化曲线。通常用功率密度曲线的最高点来表示系统获得的最大功率[12]。

1.3.2 COD、纤维素测定与库伦效率计算方法

本试验通过监测沼液COD去除率考查MFC对发酵沼液无害化处理效果，COD测量的方法为重铬酸钾氧化法，利用多参数水质测定仪（LY-4DA型）进行测定。测量前分别取待测液 15 mL，用粗滤纸过滤，离心机（TGL-20）离心（6 000 r/min，5 min）后，进行测量，每组数据均测定3次，取其平均值。

发酵液中的纤维素为一般短链纤维素，可以被溶解，其测定方法为：取适量发酵液，用 4层纱布过滤去除较大颗粒与浮渣，准确量取100 mL于500 mL三角烧瓶中，加入20 mL浓HCl，于100 ℃沸水浴中加热回流1 h，降温至75 ℃后，加入1 mL冰醋酸和0.5 g亚氯酸钠继续恒温加热回流1 h。最后用经105 ℃干燥后恒质量的250 mL G4玻璃砂芯漏斗过滤，用200 mL热水洗后，分别用10 mL 95%乙醇、甲苯、丙酮洗涤1次，取下过滤器用蒸馏水清洗外部后置于 105℃干燥箱中烘干至质量恒定[13]。

在MFC的研究中用库伦效率（Coulombic efficiency，CE）衡量阳极的电子回收效率，定义为阳极有机物氧化转化的实际电量和理论计算电量的比值[14]。CE按照下式计算。

式中M为氧气的分子量，32 g/mol；t为时间，s；I为t时刻的电流，A；T为周期时间，s；n 为每摩尔氧气被还原转移的电子数；V为反应器容积，m3；F为法拉第常数，96 485 C/mol；COD0为起始COD浓度，mg/L；CODT为出水COD浓度，mg/L。

1.3.3 微生物群落多样性及结构分析

本试验采用 Illumina MiSeq测序平台对玉米秸秆发酵沼液、接种物河沟污水及未稀释沼液MFC中的阳极溶液和阳极碳毡的DNA样品进行了分析，获得其菌群结构。沼液MFC阳极溶液与阳极碳毡DNA样品取自第4产电周期结束后。首先利用DNA提取试剂盒（Omega Biotec，美国）提取4种样品中DNA，利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，确定PCR反应应加入的DNA量。然后对V3-V4区域进行16s rDNA扩增，所用引物为融合了 Miseq测序平台的通用引物 341F引物(5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-barcode-CCT ACGGGNGGCWGCAG-3')和 805R引物(5'-GACTGGA GTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGG TATCTAATCC-3')，PCR扩增反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s 进行 5 个循环；94 ℃20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s进行 20 个循环；72 ℃ 5 min。第2轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物，其反应条件为 95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s进行5个循环；72 ℃ 5 min。在25 μL PCR产物中加入体积6/10的磁珠（Agencourt AMPure XP，Beckman，美国）进行纯化，并利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒（Life，美国）对回收纯化后DNA精确定量，以方便按照1:1的等量混合后测序。最后将纯化混合后样品置于 Illumina MiSeq平台进行测序，最后利用Prinseq等软件和RDP数据库（http://rdp.cme.msu.edu/misc /resources.jsp）、Silva数据库（http://www.arb-silva.de/）等分析所得测序原始数据。

2 结果与分析

2.1 不同COD浓度沼液对MFC性能影响规律研究

2.1.1 不同浓度沼液MFC产电规律

在MFC系统稳定运行之前，需要经过启动的过程，这一阶段，是阳极底物中微生物群落在电池阳极定向选择与富集的过程，启动阶段的电压如图1所示。在MFC未正常启动时，其输出电压在一定时间范围内，保持较低水平。在接种运行75 h后，以原沼液和稀释2倍沼液为阳极底物的 MFC的输出电压开始稳步上升，在运行125 h后，其输出电压达到最大，随后稍有降低后，保持基本稳定，分别为(302±29)、(232±18) mV。以稀释4倍沼液为阳极底物的MFC，在接种运行100 h左右，其输出电压开始逐渐上升，大约在运行125 h后其输出电压达到最大并保持稳定，为(112±10) mV。而以稀释8倍沼液为阳极底物的MFC，在接种运行后200 h一直保持较低电压输出，未能正常启动。由此可以得出，即使在启动阶段，不同浓度底物的MFC输出电压值存在很大差异。此外，由于在阳极底物中存在较高比例的未分解的固形有机物质，所以与单一有机物质，如葡萄糖、乙酸等相比，产电启动时间较长，同时整个产电周期持续时间较长[15]。

图1 不同浓度沼液MFC启动阶段的电压随时间变化Fig.1 Start voltage output of MFCs with different concentration biogas slurry

图2a－图2d为外电阻1 000 Ω时，不同浓度沼液为阳极底物的MFC在4个产电周期内的电压输出情况。在MFC成功启动后，每个产电周期内，产电趋势大致呈快速上升，达到最大值后缓慢下降的过程，此过程大约持续15 d，所以在MFC正常运行过程中，每隔15 d左右需要重新注入新的料液。以原沼液与稀释 2倍沼液为阳极底物的MFC，在成功启动后的3个产电周期内，最大峰值较为接近，且能维持一段时间，证明MFC启动成功且可以稳定运行。以稀释4倍和稀释8倍为底物的MFC，启动后 3个周期产电峰值相差较大，且稳定时间较短，说明以此为底物的MFC运行稳定较差。其原因可能为，稀释倍数过大，有机物含量较小，不能维持产电微生物持续分解利用产生电能。

图2 不同浓度沼液MFC输出电压变化Fig.2 Voltage output of MFCs with different concentration biogas slurry

从图3a功率密度曲线可以看出，原沼液、稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍沼液最大功率密度分别为203.4、60.8、36.6、3.2 mW/m2。Feng等[16]曾利用单室空气阴极MFC，以不同浓度啤酒废水为底物的产电试验，发现MFC的最大功率密度随废水浓度的升高而线性增大。与本试验结果一致，本试验中沼液浓度与功率密度之间的线性拟合结果为y=0.0620x-29.234 8，R2=0.956 7（图4）。但屈原津[17]利用以谷壳发酵液为底物的单室 MFC研究发现当底物质量浓度超过4 000 mg/L时，由于MFC系统中用来产电的微生物量有限，且随着底物浓度增加，体系中有机酸含量上升，影响微生物的代谢活性，致使输出电压值降低。此现象在本试验中没有出现，说明以玉米秸秆发酵沼液为阳极底物的MFC体系中菌群结构合理，在较高COD浓度条件下可具有良好的产电性能。

图3b为不同COD浓度玉米秸秆沼液的极化曲线，分别对欧姆极化区域进行线性拟合，其结果如表2所示，从R2可以看出，稀释2倍与稀释4倍沼液的线性拟合度较高。随着有机物浓度的降低，内阻逐渐由261 Ω增大至1 822 Ω，致使其输出功率受到影响。其原因为一方面由于去离子水将沼液稀释，使溶液中电导率降低，从而增加了MFC的欧姆内阻[18]，另一方面，阳极底物浓度影响产电微生物活性，随着底物浓度升高，微生物活性越强，转移电子能力越强，输出功率就越大[19]。本试验中，以原沼液为阳极底物的双室MFC内阻高于冯雅丽等[20]报道的以玉米秸秆发酵沼液为阳极底物的单室无膜空气阴极MFC，其内阻为53～150 Ω，致使本试验所得功率密度略低于该研究。但本研究MFC内阻要远低于曹琳等[21]报道的以牛粪发酵沼液为阳极底物的单室无膜空气阴极MFC，其最大功率密度为10.98 mW/m2，远低于本研究。

图3 不同浓度沼液MFC功率密度曲线和极化曲线Fig.3 Power density and polarization curves of MFCs with different concentration biogas slurry

图4 玉米秸秆沼液浓度与最大功率密度的关系Fig.4 Relationship between biogas slurry concentrations and maximum power density

表2 不同浓度沼液MFC极化曲线线性拟合结果Table 2 Polarization curve fitting results of MFCs with different concentration biogas slurry

2.1.2 不同浓度沼液MFC有机物降解规律与库伦效率

从不同浓度沼液MFC COD去除率及库伦效率变化情况（表 3）看，COD去除率随着稀释倍数的增加而减小，除稀释8倍沼液外，CE随着稀释倍数的增加而逐渐增加，其原因为，从外电路电压输出情况看，以稀释 8倍沼液为阳极底物的MFC未能正常启动，能量回收效率较低。由于在本试验中，阳极底物停留时间较长，MFC 运行过程中扩散到阳极一定量的氧气，有机物水解过程中有部分好氧菌作用，消耗能量，所以，本试验以玉米秸秆发酵沼液为阳极底物的 MFC与其他原料为底物的MFC相比，CE较低，而且有机物含量越高，水解反应越强，所以沼液COD浓度越高，库伦效率越低。因此需进一步改进MFC构型及运行条件，以获得更高的能量回收效率。

经一个产电周期处理后，以原沼液为底物MFC阳极溶液中短链纤维素质量浓度为(289±56.4) mg/L，与未处理原沼液相比，其去除率为67.2%，由此可见，沼液中存在水解反应，纤维素等大分子有机物可被进一步降解。

表3 不同浓度沼液MFC COD变化情况和库伦效率Table 3 COD changes and CE for different concentrations biogas slurry MFCs

2.2 微生物燃料电池阳极菌群结构分析

2.2.1 菌群多样性分析

表4为4类样品菌群多样性分析（Alpha多样性），反映微生物群落的丰度和多样性，结果显示MFC反应器中阳极碳毡中操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）数目略低于阳极溶液，皆与沼液OTU数目相差较小，且都高于河沟污水。ACE和 Chao是估计群落中含OTU数目的指数，Chao在生态学中常用来估计物种总数，其数值略高于所测得的样品中的OTU数目。Shannon和Simpson指微生物多样性指数，可以看出沼液中微生物Shannon指数最高，同时Simpson指数最低，说明沼液中菌群多样性最高，菌群结构非常丰富；接种物河沟污水的Shannon指数最低，同时Simpson指数最高，说明河沟污水菌群多样性最低。

表4 菌群多样性分析Table 4 Diversity analysis of microbial communities

2.2.2 菌群结构分析

为了更好地分析原沼液、接种物、阳极溶液与阳极电极生物膜4类样品微生物群落结构的联系与差别，按照门、纲、属3个等级进行分类，如图5、图6与表5所示。

图5 4类样品中主要菌门所占比例Fig.5 Distribution of main phyla in four samples

图6 4类样品微生物群落结构分布图（以菌纲分类）Fig.6 Distribution of microbial community for four samples (class)

从图6中4种样品菌群结构来看，阳极溶液与沼液微生物菌群结构相似，其中沼液中存在最多的菌纲为Clostridia（36%），其次为 Bacteroidia（30%）、Synergistia（8%）、Flavobacteria（7%）、Spirochaetia（3%）。其中，Clostridia菌纲属于Firmicutes菌门，可以产生纤维素分解酶，可将纤维素分解为糖、有机酸及醇类等小分子物质[22-23]，其在阳极溶液中约占 22%，在阳极碳毡生物膜上占 10%；Bacteroidia和 Flavobacteria属于Bacteroidetes菌门，Bacteroidia可水解包括纤维素等复杂的有机物质[24-25]，在阳极溶液中占 39%，在阳极碳毡中占 20%；Flavobacteria广泛存在与自然界泥土污水等，可分解碳水化合物产酸，在阳极溶液和阳极碳毡中均占5%左右。以上3种菌纲为MFC阳极中起到水解作用的主要菌群。Spirochaetia是一类广泛存在于厌氧发酵中菌纲，可将糖类物质进一步水解为酸[26]，在阳极溶液中约占2.3%，它可将MFC中大分子物质分解为VFA。此外，原沼液中还含有 2%的 Betaproteobacteria与 1%的Gammaproteobacteria， Kim 等[27]研 究 表 明Betaproteobacteria和 Gammaproteobacteria菌纲可参与MFC的产电，由此可见沼液中也含有少量产电细菌，这2种菌纲在阳极溶液中占有量为3%～4%。由于沼液中产甲烷菌属于严格专性厌氧菌，在试验操作过程中，所用沼液经过取样过滤等环节，与空气接触，所以使得所测沼液中携带的产甲烷菌含量很少，因此MFC中几乎不含有产甲烷菌，不会与产电微生物产生底物竞争。如表 5所示，MFC阳极溶液中的水解细菌以 Cloacibacillus、Proteiniphilum、Clostridium和Sphaerochaeta等几种菌属为主，主要来源于发酵沼液，他们可将短链纤维素、淀粉和蛋白质等物质分解为小分子的糖和酸等，可为产电微生物提供直接分解底物[28]。

与沼液和阳极溶液相比，接种物河沟污水中菌群结构较为简单，只含有 5类菌门，18类菌纲，其中Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria是接种物中三大主要菌门，分别占其微生物总量的 75%、16%和6%。与沼液菌群结构不同，接种物中Bacteroidetes菌门主要以 Flavobacteria为主，占该菌门 80%。在Proteobacteria下主要包含 4个菌纲分别为Betaproteobacteria（65%）、Gammaproteobacteria（24%）、Alphaproteobacteria（10%）、和 Deltaproteobacteria（1%）（图6），且这4类菌纲均包含产电微生物[29]，在阳极碳毡生物膜上分别占微生物总量的11%、20%、8%和2%。有研究表明以葡萄糖和谷氨酸盐为底物的MFC菌群中以Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria菌纲为主[27]；以醋酸盐为底物的 MFC 的微生物群落以Deltaproteobacteria菌纲为主[30]，而在以复合生物质为底物的MFC中，几种微生物的分布会随着MFC运行时间和运行状态的不同而有所不同[31]。

如表 5所示，在阳极碳毡生物膜上检测到约 5%的Pseudomonas菌属，属于Gammaproteobacteria菌纲，它可以产生化学中介体绿脓菌素，可将电子转移到电极[32]。此外，经过分析阳极碳毡中分布较多的菌属还有Azotobacter、Solibacillus和Paracoccus 3类菌属，分别约占阳极碳毡生物膜微生物总量的 12%、5.46%和 5.3%，分别属于 Gammaproteobacteria、Clostridia和Alphaproteobacteria 3类菌纲，推测此3类菌属可能参与玉米秸秆发酵沼液MFC的产电过程。在本试验MFC中未检测到文献中广泛报道的产电细菌 Shewanella 和Geobacter菌属[25,33]，可能与接种物不同或所用阳极底物不同有关。除此之外，阳极生物膜上存在约 5%的Hydrogenophaga菌属，主要来自接种物河沟污水，此类菌属可消耗阳极产生的H2，降低沼液MFC产电性能，也是导致本试验中MFC库伦效率较低的原因之一。

表5 所测得主要菌属在4类样品中所占比例及所属菌纲Table 5 Main genus consisted in four samples and their related class %

通过以上分析可知，玉米秸秆沼液MFC阳极溶液中菌群主要来源于沼液，以水解细菌为主；阳极碳毡生物膜上的微生物主要来源于接种物，以产电菌为主。试验证明，以玉米秸秆发酵沼液为阳极底物的MFC菌群结构合理，MFC可以利用沼液中的水解细菌进一步分解沼液中的纤维素等大分子物质，同时可以富集接种物中的产电细菌，分解小分子有机物产生电能，避免VFA大量积累。来自于沼液中的水解细菌与来自于接种物中的产电菌在MFC体系中可以互利共生。所以在较高COD浓度条件下，MFC可持续产电，并未出现高浓度抑制现象。

3 结 论

1）通过对以不同化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）浓度沼液为阳极底物的微生物燃料电池（microbial fuel cell，MFC）研究，当初始COD质量浓度为(3 618.6±55.6) mg/L时，其最大功率密度为 203.4 mW/m2，COD去除率可达63%，并且随着沼液中有机物浓度降低，MFC运行稳定性越差，最大输出功率密度成线性降低。

2）通过微生物菌群多样性和菌群结构分析可知，MFC可以利用沼液中的水解细菌分解沼液中的纤维素等大分子物质，主要以 Clostridia、Flavobacteria和Bacteroidia菌纲为主，同时可以富集接种物中的产电细菌，分解小分子有机物产生电能，2类微生物可以互利共生。以玉米秸秆发酵沼液为阳极底物的MFC中菌群结构合理，并未出现高浓度抑制现象。

3）阳极生物膜中的主要产电菌属为 Pseudomonas，约占MFC阳极生物膜微生物总量的5%，对于以秸秆类沼液为阳极底物的MFC，可人为接种或富集此类菌属，以缩短MFC启动时间，提高产电效率。