黄芪多糖对LPS诱导的THP-1源巨噬细胞产生细胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的影响*

费煜畅 郑戴波 潘 磊 陈培丰#

1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053

2 浙江省中医院 浙江 杭州 310006

黄芪多糖（APS）作为黄芪主要的抗癌成分之一，较多研究已表明其在抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成等方面发挥作用，且可调节机体免疫水平[1-3]。基于APS在这些方面的研究，本实验通过观察不同浓度APS及不同作用时间下脂多糖（LPS）诱导的THP-1源巨噬细胞存活率和产生IL-10、IL-12、TNF-α的表达量，探讨APS对THP-1源巨噬细胞免疫功能的影响，为进一步研究黄芪多糖的免疫调节作用机制及中药黄芪的临床抗癌效用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料：人单核细胞（THP-1）细胞，购自上海中科院细胞库。黄芪多糖注射液（APS）由西安瑞盈生物科技有限公司生产（纯度＞90%）。CCK-8（联科公司）；佛波酯（PMA）、LPS（美国Sigma公司）；RT-PCR试剂盒和逆转录试剂盒（日本TAKARA株式会社）；ELISA试剂盒（eBioscience公司）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）。超净工作台（Heal Force公司）；荧光化学显微镜（日本Nikon公司）；CO2恒温孵育箱、Thermo 3111、温度梯度PCR仪、Biometra T-Gradient、ABI 7500 Real-Time PCR仪等（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 造模方法：将THP-1细胞接种于六孔板，密度为（1～2）×106/ml，每孔细胞中加入浓度为100mg/L的PMA，刺激48h后细胞形态学上转变为椭圆形、梭形或伸出伪足，由悬浮状态转变为贴壁状态，表明THP-1细胞已成功转化为巨噬细胞，在巨噬细胞内加入LPS（100ng/ml），共培养刺激6h建立炎症模型。

1.2.2 分组及标本选取：对药物浓度进行筛选，将THP-1源巨噬细胞（1.0×105个细胞/孔）接种于24孔细胞培养板，设置APS各浓度梯度组（0mg/ml、0.02mg/ml、0.2mg/ml、2、20mg/ml、40mg/ml），每孔中各加入含不同浓度APS的新鲜培养基作用24h，分别收集各组细胞，提取RNA，进行RT-PCR，筛选合适的APS浓度。实验分组：将造模细胞接种于24孔培养板，每孔1.0×105个细胞，分别设置为THP-1空白对照组、THP-1+LPS模型组、THP-1+LPS+APS低浓度组、THP-1+LPS+APS高浓度组，各组分别加入2mg/ml、20mg/mlAPS作用24h、48h，结束以后各自加入LPS（100ng/ml）刺激6h，并将提取的各组细胞置于EP管中，在7.500g、4℃下离心5min，并将各组细胞培养上清液和THP-1源巨噬细胞收集起来。

1.2.3 RNA的提取、RT-PCR：提取各组细胞于EP管中，用TRIzol试剂裂解细胞，用DNA/RNA计算器系列分光光度计进行RNA浓度测定。用逆转录试剂盒配制15μl反应体系，采用温度梯度PCR仪逆转录反应获得cDNA。利用Primer Premier5.0软件设计人TNF-α和IL-12、IL-10引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。应用ABI7500 Real-Time PCR仪进行检测。RT-PCR反应参照SYBR®Premix Ex Taq TM说明书进行。使用ABI相对定量软件进行扩增结果分析，基因相对表达量(处理组/未处理组)=2-ddCt，其中ddCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)未处理组。引物序列：TNF-α 5’GAC ACC ATG AGC CA GAA AG 3’5’GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC 3’IL-12 5’GAG AGT CAG AGG GGA CAA CAA 3’5’GTG AAC GGC ATC CAC CAT 3’IL-10 5’CCT GCC TAA CAT GCT TCGA 3’5’ATG TCT GGG TCT TGG TTC TCA 3’

1.3 观察指标：分述如下。

1.3.1 细胞形态学改变及细胞活力：通过光镜观察，确认THP-1细胞分化为巨噬细胞。在96孔板中每孔（5000个细胞/孔）加入细胞悬液100μl，细胞培养箱中预孵育细胞24h，加入不同浓度的APS各10μl；继续孵育一段时间后，再每孔加入CCK-810μl；继续将细胞板放入培养箱中孵育1～4h；在酶标仪上读取OD450值、参考波长OD650值。存活率（%）=（ODTHP-1-ODAPS）/ODTHP-1×100%。

1.3.2 细胞因子mRNA表达水平：分别提取各组细胞总RNA后，用RT-PCR技术检测IL-10、IL-12和TNF-αmRNA基因表达量。进行产物荧光分析和融解曲线分析，基因相对表达量(处理组/未处理组)=2-ddCt，其中ddCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)未处理组。

1.3.3 细胞上清液中细胞因子含量：收集各组细胞培养上清，分别用人TNF-α及IL-12、IL-10ELISA试剂盒检测细胞因子表达水平并绘制出各细胞因子的标准曲线，计算各组细胞培养液中的细胞因子含量。

2 结果

2.1 炎症模型：在荧光倒置显微镜下（放大40倍）可见THP-1细胞在形态学上转变为椭圆形、梭形或伸出伪足，并由悬浮状态转为贴壁状态，表明THP-1细胞已转化为巨噬细胞。

2.2 不同APS浓度对THP-1源巨噬细胞活性的影响：用CCK-8法检测细胞活性，观察不同浓度APS（0～40mg/ml）分别作用THP-1源巨噬细胞24h、48h后的细胞增殖情况。结果显示，当黄芪多糖浓度为2mg/ml和20mg/ml时，细胞存活率较高；当黄芪多糖作用时间为48h时，细胞生存率低于50%，不利于细胞生长及后续实验进行。经浓度筛选后，APS浓度为2mg/ml、20mg/ml时，THP-1巨噬细胞生存率较高且细胞因子的相对表达量较高且稳定。

2.3 利用RT-PCR检测IL-10、IL-12、TNF-α mRNA表达量并筛选出合适的药物浓度：将空白THP-1源巨噬细胞分泌的各细胞因子mRNA表达量作为表达标准量，IL-10、IL-12、TNF-α mRNA的标准表达量水平不尽相同。不论APS的高、低浓度，IL-12mRNA表达量均高于于空白对照组；且当APS浓度在2mg/ml时，IL-12mRNA表达量显著高于空白对照组。而IL-10及TNF-α mRNA表达量不呈浓度依赖性，两者皆在APS浓度为在2mg/ml及在20mg/ml时表达量较高。通过实验数据及绘图结果可知，APS浓度为2mg/ml、20mg/ml时对THP-1源巨噬细胞增殖活力影响相对较小，故以2mg/ml、20mg/ml浓度的APS进一步研究APS对各细胞因子转录水平及蛋白表达的影响。

2.4 2mg/ml及20mg/ml浓度APS对各细胞因子转录水平的影响：见表1。

表1 APS对LPS诱导的THP-1源巨噬细胞产生IL-10、IL-12、TNF-α的表达量影响（±s，pg/ml）

表1 APS对LPS诱导的THP-1源巨噬细胞产生IL-10、IL-12、TNF-α的表达量影响（±s，pg/ml）

注：同时间段，与THP-1空白对照组比较，*P＜0.05；与THP-1+LPS模型组比较，●P＜0.05；与同组24h比较，#P＜0.05。

组别THP-1空白对照组 (24h)THP-1+LPS模型组 (24h)THP-1+LPS+APS低浓度组（24h)THP-1+LPS+APS高浓度组（24h)THP-1空白对照组(48h)THP-1+LPS模型组(48h)THP-1+LPS+APS低浓度组（48h)THP-1+LPS+APS高浓度组（48h)TNF-αmRNA表达量1.0000±0.00000 1.1400±0.01732*1.9033±0.01528*●1.6833±0.01528*●1.2067±0.10066 2.2833±0.01528*2.3700±0.03000*#2.3133±0.04163*#n 3 3 3 3 3 3 3 3 IL-10mRNA表达量1.0000±0.00000 18.0367±0.16803*10.0367±0.17786*●5.0333±0.17243*●1.3933±0.03055 18.8000±0.20000*3.7667±0.25166*●#2.6333±0.35119*●#IL-12mRNA表达量1.0000±0.00000 4.4000±0.36056*9.4000±0.36056*●7.2333±0.25166*●1.6733±0.02517 10.9000±0.36056*13.9000±0.36056*●#12.8833±0.35473*●#

2.5 2mg/ml及20mg/ml浓度APS对IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表达水平的影响：见表2。

表2 APS对LPS诱导的THP-1源巨噬细胞产生IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表达量影响（±s，pg/ml）

表2 APS对LPS诱导的THP-1源巨噬细胞产生IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表达量影响（±s，pg/ml）

注：同时间段，与THP-1空白对照组比较，*P＜0.05；与THP-1+LPS模型组比较，●P＜0.05；与同组的24h比较，◆P＜0.05。

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3 讨论

黄芪，具有益卫固表、升阳举陷，托毒生肌等功效，是临床常用扶正抗癌中药[1]。黄芪多糖（APS）作为黄芪的主要抗癌成分，已被证实可作为免疫调节剂，在抗肿瘤方面发挥积极作用[3-4]。细胞因子在肿瘤免疫中发挥重要作用，主要参与吞噬病原体、杀伤肿瘤细胞，并可通过诱导抗肿瘤免疫长期维持或消除已形成的肿瘤来实现免疫调控[5]。IL-12通过诱导辅助T细胞分化，促进辅助Th1细胞增殖来参与细胞免疫，发现其能够抑制肿瘤血管生成，在抗肿瘤免疫中发挥正向调节作用。TNF-α是能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的多功能细胞因子，能直接杀伤和抑制肿瘤细胞[6]，在分子水平发挥作用[7]。IL-10作为免疫抑制因子，通过抑制多种效应分子来抑制机体的抗肿瘤免疫，通过诱导产生IL-2，IFN-C，抑制IL-12及TNF-α的表达，从而抑制了细胞免疫应答[8]。目前许多学者致力于研究中药制剂中的有效成分是否能够提高巨噬细胞活性，进一步实现抗肿瘤免疫，但关于黄芪主要抗癌成分——黄芪多糖（APS）对人单核细胞株THP-1源巨噬细胞的免疫调节作用的研究尚无文献报道。基于此，本实验将APS作用于THP-1源巨噬细胞，运用RT-PCR及ELISA法观察其对经LPS诱导的THP-1源巨噬细胞的表达TNF-α和IL-12、IL-10的影响，以明确黄芪多糖对巨噬细胞免疫功能的确切影响。

本次实验结果表明，一方面黄芪多糖能有效激活THP-1源巨噬细胞，下调其IL-10的基因表达量；并发现不同浓度APS对IL-10mRNA表达的下调作用呈一定的浓度-效应关系（P＜0.05）。此外，ELISA法检测细胞上清液中细胞含量也进一步验证了APS能够降低由LPS刺激引起的IL-10表达的增加，这有可能是APS发挥抗肿瘤作用的机制之一。另一方面黄芪多糖能有效激活THP-1源巨噬细胞，上调其IL-12、TNF-α的基因表达量，且两者的表达量与APS的浓度与时间呈一定的依赖关系。这与APS对IL-10的调节作用相反，也体现了炎症细胞因子在抗炎及促炎两者之间的相互制约关系。

综上，笔者通过本实验发现，黄芪多糖(APS)可能通过影响相关因子表达来调控机体免疫调节从而实现抗肿瘤作用，且呈一定的浓度与时间依赖性，这为中药黄芪及其有效抗肿瘤成分黄芪多糖在肿瘤免疫治疗方面提供一定参考依据，但其具体作用机制仍有待进一步的探索及验证。