肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对胰腺癌细胞凋亡的影响

朱颖 汤玉茗 黄佳 李为光 章永平 王建承 张学军 姚玮艳

上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科，上海 200025

本课题组既往研究结果显示全反式维甲酸能诱导多株胰腺癌细胞凋亡[1]，通过基因芯片检测发现全反式维甲酸诱导胰腺癌细胞凋亡过程中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis induced ligand, TRAIL)的受体(TRAIL-R)显著升高，经体内外实验证实TRAIL的表达随全反式维甲酸诱导时间的延长而增高。本研究旨在通过瞬时转染TRAIL基因进一步探索TRAIL对胰腺癌细胞的促凋亡机制。

材料与方法

一、细胞株及质粒的制备、鉴定及转染

3株人胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988和BxPC3，携带TRAIL基因的真核表达载体pCA13(pCA13-TRAIL)、空质粒(pCA13)和带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的pCA13-EGFP质粒由中科院上海生命科学研究院生化细胞所提供。制备感受态大肠杆菌，分别加入pCA13-TRAIL、pCA13或pCA13-EGFP混匀，处理后涂布于LB平板上常规培养10 h，挑取单个克隆接种于培养基中，获取细菌，常规抽提质粒。

通过BglⅡ酶切和SalⅠ、HidⅢ双酶切及PCR鉴定TRAIL质粒是否制备成功。采用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)将质粒转染胰腺癌细胞株(pCA13-TRAIL组)，以空质粒转染作为对照组(pCA13组)。以转染pCA13-EGFP的细胞在高倍视野下计算质粒转染率，即质粒转染率=带绿色荧光细胞数/总细胞数×100%。

二、TRAIL mRNA和蛋白表达检测

分别于转染后24、48、72 h收取细胞，抽提总RNA及制备蛋白匀浆。采用RT-PCR方法检测TRAIL(860bp)mRNA表达。引物正义序列为5′-ATGGCTATGATGGAGGTCCAG-3′，反义序列为5′-ACTGGCTTCATGGTCCATGTC-3′；内参β-actin引物正义序列为5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′；反义序列为5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′。引物由上海博亚生物技术有限公司设计合成。以目的条带与内参条带的灰度值比表示mRNA 相对表达量。

蛋白定量后常规行蛋白质印迹法检测TRAIL蛋白表达，以β-actin为内参。鼠抗人TRAIL单抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，1∶100稀释；鼠抗人β-actin抗体购自美国Sigma公司，1∶4 000稀释。羊抗鼠二抗1∶4 000稀释。最后ECL发光，X片曝光显影后用凝胶图像处理系统扫描条带灰度值，目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白表达量。

三、细胞凋亡的形态观察及凋亡率检测

细胞用2.5%戊二醛4℃固定1 h以上。常规包埋、超薄切片，通过透射电镜观察细胞形态。收集各组对数生长期细胞，离心后弃上清液，重悬细胞，密度调整为2×105个/ml。采用TUNEL法检测细胞凋亡率。TUNEL试剂盒购自美国Roche公司，严格按说明书操作。用荧光显微镜(日本Nikon公司)在波长510～520 nm下观测TUNEL染色，在波长400～420 nm下观察Hoechst染色。

四、TRAIL-R1、R2蛋白表达检测

取含106胰腺癌细胞的悬液滴在涂有polylysine的玻片上，加10 μl PE荧光标记的鼠抗人TRAIL-R1或TRAIL-R2抗体(美国Diaclone Biosciences公司)，荧光显微镜拍照记录后置流式细胞仪检测TRAIL-R1、R2的表达，根据细胞荧光强度分析计算细胞TRAIL-R1或TRAIL-R2表达率。

五、caspase-3蛋白表达检测

采用免疫组织化学方法检测caspase-3的表达。收集细胞加穿透液(0.1%TritonX-100，0.1%柠檬酸钠溶液)冰上作用2min，离心后加兔源性caspase-3抗体(1∶100，美国Cell Signaling Technology公司)，洗涤后加Cy-3 荧光标记抗兔二抗(1∶1 000，美国Jakson公司)，用荧光显微镜拍照记录，计算阳性细胞占总细胞的百分率。

六、统计学处理

结 果

一、胰腺癌细胞的质粒转染率

经酶切鉴定，pCA13-TRAIL重组质粒成功扩增出1条860 bp的TRAIL基因条带，表明携带TRAIL的重组质粒构建成功。SW1990、PaTu8988和BxPC3细胞的质粒转染率分别为(69.88±9.92)%、(26.52±10.01)%和(38.60±11.02)%，其中PaTu8988的转染率较低。

二、胰腺癌细胞转染质粒后TRAIL mRNA及蛋白表达的变化

SW1990、PaTu8988和BxPC3的pCA13-TRAIL组24 h后TRAIL mRNA的表达量分别为0.5967±0.0605、0.3250±0.0323和0.5033±0.0879，48 h后分别为0.6460±0.0973、0.3367±0.0649和0.5310±0.0776；24 h后TRAIL蛋白的表达量分别为0.5490±0.0717、0.2813±0.0595和0.4107±0.1084，48 h后分别为0.6227±0.0439、0.3633±0.0541和0.4267±0.0829。pCA13-TRAIL组mRNA和蛋白的表达均显著高于pCA13组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。

三、胰腺癌细胞转染质粒后细胞凋亡率的变化

SW1990、BxPC3、PaTu8988细胞转染TRAIL后的细胞凋亡率均较pCA13组增加，差异有统计学意义(表1)。

四、胰腺癌细胞转染质粒后TRAIL-R1、R2的表达变化及其与细胞凋亡率的相关性

转染TRAIL后SW1990、BxPC3、PaTu8988细胞TRAIL-R1表达均上调，除转染72 h的BxPC3细胞外，其他各时间点的表达均显著高于pCA13组，差异有统计学意义(表2)；转染TRAIL后SW1990、BxPC3细胞TRAIL-R2表达均上调，除转染24 h的SW1990细胞外，其他各时间点的表达均显著高于pCA13组，差异有统计学意义，而转染TRAIL后PaTu8988细胞的TRAIL-R2表达与pCA13组差异无统计学意义(表2)。

表1 3株人胰腺癌细胞转染质粒后的细胞凋亡率

表2 3株人胰腺癌细胞转染质粒后的TRAIL-R1、TRAIL-R2阳性表达率

转染TRAIL后SW1990细胞的TRAIL-R1、R2表达与凋亡率均呈正相关(r值分别为0.764、0.683，P值均<0.05)；PaTu8988细胞的TRAIL-R1的表达与凋亡率呈正相关(r=0.743，P<0.05)，TRAIL-R2表达与凋亡率呈弱相关(r=0.507，P=0.093)；BxPC3细胞的TRAIL-R2表达明显升高，与凋亡率呈正相关(r=0.743，P<0.01)，TRAIL- R1表达与凋亡率呈弱相关(r=0.573，P=0.052)。

五、胰腺癌细胞转染质粒后caspase-3蛋白表达的变化

转染pCA13-TRAIL质粒后，SW1990、PaTu8988和BxPC3细胞caspase-3阳性表达率分别为(14.64±5.35)%、(9.92±5.50)%和(16.12±6.74)%，均较pCA13组的(3.01±1.50)%、(1.75±0.50)%和(3.79±1.58)% 显著增加，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

六、胰腺癌细胞转染质粒后细胞超微结构改变

透射电镜下可见细胞出现凋亡的各种特征(图1)，细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，核膜皱褶，胞质紧实，胞膜起泡，凋亡小体形成，被邻近细胞吞噬。

图1 转染pCA13-TRAIL后人胰腺癌细胞株SW1990(1A)、PaTu8988(1B)、BxPC3(1C)电镜下改变(×7400倍，↑为凋亡细胞)

讨 论

胰腺癌治疗手段中，基因和细胞疗法是可行的，并且可以与标准治疗和(或)免疫治疗协同抗肿瘤[2]。基因治疗的有效靶点包括抑癌基因p53、K-ras基因突变，抗血管生成基因受体VEGFR、自杀基因HSK-TK，胞嘧啶脱氨酶和细胞色素P450等[3]。TRAIL通过与其受体TRAIL-R1和TRAIL-R2结合，诱导死亡诱导信号复合物的形成，激活凋亡级联反应[4]。

瞬时转染携带基因的病毒质粒使动物细胞表达目的基因被广泛运用[5]，一种新的嵌合型腺病毒Ad.5/3-mda-7通过提供mda-7/IL-2显示出更好的疗效[6]。本研究利用携带TRAIL基因的真核载体pCA13转染胰腺癌细胞，转染后细胞内TRAIL表达上调，48 h达高峰，且与细胞凋亡率升高呈正相关，提示TRAIL能诱导其受体R1、R2的表达，进而促进细胞凋亡。BxPC3细胞转染后TRAIL-R1、R2的表达量较SW1990、PaTu8988细胞株低，但转染后凋亡率并不低，可能与其转染后TRAIL-R2表达量显著增加有关，提示TRAIL-R1、R2均参与了TRAIL诱导的胰腺癌细胞凋亡。

caspase-3的活性可作为细胞凋亡的指标[7]。有学者认为某些细胞株对外源性TRAIL耐药，但二甲双胍明显增强TRAIL诱导的直肠癌细胞凋亡，并显示caspase被激活[8]。本研究结果也证实caspase-3的活化在TRAIL所诱导的细胞凋亡中起一定的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突