基于不同年龄阶段大鼠对慢性温和不可预知应激模型的优化

刘 飞,雷 刚,刘 鹏,吴甜甜,党永辉*

(1 西安交通大学口腔医学院,陕西省牙颌疾病临床研究中心,西安 710004;2 西安交通大学医学部法医学院;*通讯作者,E-mail:psydyh@mail.xjtu.edu.cn)

大鼠慢性温和不可预知应激(unpredictable chronic mild stress,UCMS)模型由Katz的研究团队在20世纪80年代首次建立[1],最初的实验方案包括给予电击、冷水刺激、束缚、颠倒光照周期等应激措施,但是在随后的一段时间内,该模型由于动物伦理方面的考虑而应用较少。Willner等[2]在前期的应激方案上进行改进,将应激的多样性提高,更加类似于人类抑郁症发病的模式;增加了动物伦理方面的考量,将应激源调整的更加温和。

UCMS模型可以很好地展现出人类抑郁症的核心症状,即糖水偏好指数下降所反映的快感缺乏[3,4]。该模型在表观效度、结构效度和预测效度上均表现出较大的优势,且其引发的行为异常可持续数周至数月,具有较好的时效性[5]。因此UCMS模型很可能是最有效的、应用最广泛的用来模拟焦虑和抑郁的动物模型[6]。本课题组前期的研究结果表明,社会隔离诱发的躯体接触性攻击行为会使暴露于慢性应激的社会隔离雄性小鼠的焦虑和抑郁样行为更易于发生[7]。另外,处于不同生命阶段的个体接受应激后均会对大脑结构、功能和行为表现产生不同程度的影响。有研究报道,人类在生命早期受到的负性应激会导致焦虑、抑郁、人格障碍和进食障碍等精神疾病的发病风险显著增加[8]。在本实验中,我们继续沿用加入社会隔离和社会交往应激的UCMS模型,并比较不同年龄阶段大鼠对该模型的敏感程度,为后续实验提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物购于西安交通大学医学实验动物中心(陕西省医学实验动物中心),动物合格证编号为SCXK(陕2012-003)。共购买幼年(3周龄)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,平均体质量(60 ±5 g);成年(8周龄)SD大鼠20只,平均体质量(210 ±10 g)。分组之前大鼠采用4只/笼群养,经过糖水基线筛选和剔除后分组,对照组于4只/笼群养,UCMS组单笼单只饲养。饲养环境为室温(22 ±1)℃,湿度在(60 ±5)%;日光灯采光,正常光暗周期为12 h/12 h(7:00 a.m-7:00 p.m),自由获取食物和水,每周更换饲养笼及垫料。本实验经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准(No.2017-536)。

1.2 实验流程

将实验动物饲养于实验环境适应3 d后,进行糖水基线测试和筛选,剔除不能获得稳定糖水偏好的大鼠后将所有大鼠随机分为实验组(UCSM组)和对照组。随后对UCMS组进行连续5周的慢性温和不可预知应激。在应激后第1，3，5周分别对所有大鼠进行糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT)和强迫游泳实验(force swimming test,FST)。

1.3 糖水偏好基线值测定

自环境适应后连续的2周时间内对所有大鼠进行5次糖水偏好测试。具体方法如下:在测试前20 h对大鼠禁水,测试前2 h将所有大鼠进行单笼放置。测试时在每个饲养笼放置双瓶饮水,一瓶为自来水,另一瓶为1%蔗糖溶液,蔗糖溶液为现配现用。测试时间为1 h,测试前后分别称量各瓶质量,即1 h内大鼠的饮水消耗量,计算糖水偏好指数[9]。糖水偏好指数=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。测试结束后恢复大鼠4只/笼群养,并给与正常饮水。测定糖水偏好基线值的目的包括:使大鼠学习双瓶饮水测试方法;剔除不能获得稳定的糖水偏好值,或天生无糖水偏好的大鼠,保证后续实验中评估快感缺乏程度的可比性[10]。

1.4 建立大鼠UCMS模型

对UCMS组大鼠每天上、下午分别随机给予慢性温和应激,处理包括:持续光照,持续黑暗,频闪照明、昼夜颠倒、倾斜笼子,禁食、禁水、低温、湿垫料、空笼子、夹尾、束缚等。按随机化方法对各应激处理排表,避免大鼠预料其出现而适应[11]。

1.5 SPT

从给与大鼠应激开始,每两周进行SPT,实验方法见1.3。SPT测试时间为应激开始后每单周周六上午10:00-11:00。

1.6 FST

从给与大鼠应激开始,每两周进行FST,测试时间为应激开始后每单周周六及周日下午14:00-16:00。

大鼠FST实验分适应和测试两天进行。适应(第1天):将大鼠置于25 ℃的深水中强迫游泳15 min,取出后拭干、归笼;测试(第2天):同样条件下强迫游泳6 min,记录大鼠的不动时间。不动时间是指大鼠漂浮在水中,没有挣扎且仅能够维持头部位于水面以上的时间,以此判断大鼠的抑郁样行为[12,13]。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 实验动物筛选

经过两周糖水偏好值基线测量,剔除不能获得稳定的糖水偏好值或未表现出糖水偏好的大鼠8只。剩余32只大鼠按照既定的实验流程进行处理和分组,每组8只大鼠。

2.2 不同年龄大鼠糖水偏好指数随应激时间的变化

不同年龄大鼠糖水偏好指数随应激时间的变化见图1。幼年大鼠对照组和UCMS组的基线糖水偏好指数差异无统计学意义(t=0.474,P=0.634);经过1周的应激后,UCMS组大鼠的糖水偏好指数显著低于对照组大鼠(t=2.192,P=0.046);在应激3周(t=4.307,P=0.001)和5周(t=6.242,P<0.001)后,UCMS组大鼠的糖水偏好指数持续下降,与对照组相比差异均具有统计学意义(见图1A)。成年大鼠对照组和UCMS组的基线糖水偏好指数无统计学差异(t=0.285,P=0.78);经过1周(t=0.443,P=0.664)和3周(t=1.734,P=0.105)的应激,UCMS组与对照组大鼠的糖水偏好指数差异无统计学意义;应激5周后,UCMS组大鼠的糖水偏好指数显著低于对照组(t=3.587,P=0.003,见图1B)。

A.幼年大鼠 B.成年大鼠同一时点与对照组相比,* P<0.05,* * P<0.01,* * * P<0.001图1 不同年龄大鼠糖水偏好指数随应激时间的变化Figure 1 Changes of sucrose consumption in different age rats after different time

将幼年对照组、幼年UCMS组、成年对照组和成年UCMS组大鼠各自在4个时点上的糖水偏好平均值进行比较,结果显示,幼年UCMS组的糖水偏好平均值较其他三组显著下降(F=19.927,P<0.001,见图2)。成年UCMS组与对照组相比,糖水偏好指数差异无统计学意义。

与其他三组比较,* * * P<0.001图2 不同年龄大鼠糖水偏好指数平均值比较Figure 2 Comparison of sucrose consumption among four groups

2.3 不同年龄大鼠FST不动时间随应激时间的变化

图3显示不同年龄大鼠FST不动时间随应激时间的变化。应激后第1周,无论是幼年大鼠(t=0.854,P=0.408)还是成年大鼠(t=0.237,P=0.816),对照组与UCMS组在FST中的不动时间比较均无统计学差异(见图3A)。应激后第3周,幼年大鼠UCMS组的不动时间显著长于对照组(t=3.464,P=0.006);而成年大鼠对照组和UCMS组在FST中的不动时间比较仍无统计学差异(t=0.849,P=0.41,见图3B)。应激后第5周,幼年大鼠UCMS组的不动时间显著长于对照组(t=3.48,P=0.004),成年大鼠UCMS组的不动时间与对照组相比首次出现统计学差异(t=2.207,P=0.045,见图3C)。

将幼年对照组、幼年UCMS组、成年对照组和成年UCMS组大鼠各自在3个时点上的FST不动时间平均值进行比较。幼年UCMS组的不动时间平均值较其他三组显著增加(F=19.663,P<0.001，见图4)。成年UCMS组与对照组相比,不动时间的差异无统计学意义。

A.应激后第1周 B.应激后第3周 C.应激后第5周同年龄与对照相比,* P<0.05,* * P<0.01图3 不同年龄大鼠FST不动时间随应激时间的变化Figure 3 Changes of immobility time in different age rats after different stress time

与其他三组相比,* * * P<0.001图4 不同年龄大鼠FST平均值比较Figure 4 Comparison of immobility time among four groups

3 讨论

UCMS模型是模拟焦虑和抑郁最有效的动物模型之一,研究者们一直对该模型中所涉及到的应激类型、方法和伦理学考量等进行不断的改进。在我们课题组的前期工作中,对文献中广泛使用的方法进行改良,将隔离小鼠彼此躯体性攻击作为UCMS程序的一种应激,结果发现社会隔离引起的攻击行为可以加重啮齿类动物因UCMS引起的快感缺乏行为和焦虑、抑郁样行为,包括SPT中糖水偏好指数的下降、明暗箱中穿梭次数和在明箱内停留时间的增加,以及TST和FST中不动时间的增加[7,14]。肖玲等[15]探讨了应激时程长短对体质量为200-250 g的大鼠在UCMS模型中行为学表现和海马神经可塑性相关蛋白表达的影响,结果显示应激3周后大鼠海马中神经元再生和神经可塑性相关蛋白(包括CREB、BDNF及Bcl-2)及mRNA表达均下降,而应激2周大鼠与对照组大鼠相比则未出现显著的变化,提示UCMS的应激持续时间与模型构建效果之间存在关联。

除了应激之外,实验动物的自身属性也会对UCMS的效果产生不同的影响。例如,大鼠和小鼠对应激的反应不同,因此在UCMS中应激源的强弱程度以及对抗抑郁药的反应时间和效率均存在种属差异[16]。Xing等[17]发现体质量为150-200 g的大鼠在UCMS模型中的行为学、血清中皮质酮水平以及对文拉法辛抗抑郁效果上均存在性别特异性,雌性大鼠在同样的应激源中HPA轴的异常调控更为敏感,雄性大鼠对文拉法辛在缓解探索行为和快感缺乏行为的表现则更为理想。

另外,处于不同生命阶段的个体接受应激后均会对大脑结构、功能和行为表现产生不同程度的影响。在Teicher等[18]的综述中指出,在童年期遭受负性应激(包括虐待、社会隔离、家庭暴力和目睹家庭暴力等)的儿童可能会影响杏仁核和海马的发育,并导致其成年后炎症反应、缺血性心脏病、关节炎、代谢综合征和癌症的发病率均较正常组高,有45%会在成年后表现出不同程度和类型的精神障碍。在实验中,我们对不同年龄大鼠在UCMS模型中的行为学表现进行比较。在SPT实验中,幼年组和成年组大鼠的糖水偏好基线值并无差异,而幼年组大鼠较成年组大鼠对应激的反应速度更快,接受应激1周后糖水偏好指数就出现了显著的降低,而成年组大鼠在接受应激后5周糖水偏好指数显著低于对照组。为了将随机的应激剧烈程度造成的差异最小化,对每只大鼠所检测4个时间的糖水偏好指数取平均值后进行比较,发现幼年UCMS组的平均糖水偏好指数显著低于其他三组。在FST实验中也表现出同样的趋势和规律。因此,我们认为,幼年期大鼠接受UCMS后,行为学改变的敏感性和反应强度均高于成年期大鼠。