长链非编码RNA PRNCR1对非小细胞肺癌A549细胞迁移和凋亡的影响

王伟青,楚 晓,向 明,冯 亮,刘俊钧

(复旦大学附属上海市第五人民医院胸外科,上海 200240;*通讯作者,E-mail:w17348030234@163.com)

近50年来，肺癌的发病率和死亡率逐年增加，已经超过其他肿瘤，成为威胁人类健康的杀手之一，据人群统计学大数据显示，男性人群中肺癌的发病率和死亡率占所有恶性肿瘤的第一位；女性人群中肺癌占据第二位[1-3]。寻找更好的基因治疗靶点，为临床上肺癌患者提供新的治疗思路，仍然具有十分重要的意义。

长链非编码RNA(lncRNA)被认为可以调节癌细胞的生长、凋亡和转移。有研究证明,lncRNA PRNCR1与直肠癌、食管癌、肝癌等癌症密切相关[4-6]。然而,尚没有研究涉及lncRNA PRNCR1在非小细胞肺癌发病机制的相关研究。本研究利用慢病毒转染技术,构建lncRNA PRNCR1的shRNA干扰表达载体,探究lncRNA PRNCR1对肺癌细胞迁移和凋亡的影响,为肺癌的治疗提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清和RPMI1640培养液购自美国Gibco公司;TRIzol提取试剂盒,TaKaRa逆转录试剂盒和TaKaRa荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;Transwell小室试剂盒购自美国康宁公司;lncRNA PRNCR1,Caspase-3和Caspase-9山羊抗人一抗购自英国Abcam公司;AV-PI试剂盒购自中国杭州联科生物有限公司。

1.2 肺腺癌细胞系A549的培养

人肺腺癌细胞系A549,购自中科院上海细胞研究院。细胞经离心收集后,以2×104/cm2的密度将其种植于25 cm×25 cm的培养瓶中。加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,而后将细胞进行后续试验。

1.3 shRNA lncRNA PRNCR1慢病毒载体构建

shRNA lncRNA PRNCR1质粒是由上海吉凯公司合成,选择pHBLV-U6-GFP-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。shRNA lncRNA PRNCR1载体病毒载体的克隆切入点是XhoⅠ/BamHⅠ,环状载体编号为ENST00000001179。经过基因测序,从而证明序列的正确性。

1.4 试验分组

将人肺腺癌细胞系A549细胞分成三组:空白对照组,阴性对照组和实验组。空白对照组为未做任何处理的细胞组,阴性对照组是经空白载体的慢病毒转染的细胞组,实验组是由shRNA lncRNA PRNCR1的慢病毒干扰载体构建的慢病毒转染细胞组。以GFP为慢病毒荧光探针,用荧光显微镜观察细胞慢病毒的转染效率。

1.5 实时荧光定量PCR检测

三组细胞在融合率达80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化后放入15 ml离心管，加入1 ml的TRIzol RNAiso，裂解细胞，提取RNA后根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明书进行试验，将逆转录的cDNA保存在4 ℃冰箱中备用。根据TaKaRa荧光定量PCR试剂盒的说明书的要求，采用20 μl的反应体系，加入各样品。进行荧光定量PCR的检测。采用FS2000系统对PCR进行分析，反应条件预设为预变性95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s， 40个循环。溶解曲线：95 ℃ 5 s； 60 ℃ 1 min。降温：50 ℃ 30 s,1个循环。内参基因GAPDH和lncRNA PRNCR1引物由上海生工公司生产(见表1)。采用2-ΔΔCt的方法计算目的基因的相对表达量。

表1 引物名称和序列Table 1 Primer names and sequences

1.6 Western-blot检测lncRNA PRNCR1、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平

三组细胞慢病毒转染72 h后，加入RIPA细胞裂解液1 ml，各组细胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml离心管中，4 ℃，5 000 r/min离心5 min，取上清，95 ℃煮沸，-80 ℃保存，按照说明书制备浓缩胶10 ml，分离胶20 ml。上样后交流电电泳分离，转PVDF膜，lncRNA PRNCR1，Caspase-3和Caspase-9的一抗(1 ∶5 000稀释)加入样本PVDF膜，4 ℃避光孵育过夜(>12 h)。用PBST稀释液洗膜，重复3次，加用兔抗山羊HRP二抗(1 ∶1 000稀释)，常温避光孵育1.5 h，PBST洗涤3次，DAB显影。用Image J软件分析蛋白条带。

1.7 Transwell小室试验检测细胞的迁移

将空白对照组、阴性对照组和实验组细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照试剂盒的说明书，将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱(4 ℃)过夜融化，与预冷的无血清的RPMI1640按照1 ∶3的比例配置侵袭上室凝胶液体，以每孔55 μl凝胶包被Transwell小室的上室，37 ℃孵育2 h，使上室成胶。上室每孔接种200 μl不含血清的细胞培养液，下室加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液500 μl。Transwell板置37 ℃孵育24 h，用结晶紫染色。将Transwell板用倒置光学显微镜，拍照，细胞计数。所有试验均重复3次。

1.8 AV-PI凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡

将空白对照组、阴性对照组和实验组细胞经胰蛋白酶消化后收集,按照AV-PI的试剂盒的说明书检测三组细胞的凋亡率。流式细胞仪分析各组样本,计算各组的凋亡率。Annexin Ⅴ+/PI-为早期凋亡细胞,Annexin Ⅴ+/PI+为晚期凋亡和坏死细胞,Annexin Ⅴ-/PI+为正常细胞。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 慢病毒干扰载体的转染结果

以绿色荧光蛋白(GFP)为荧光探针,完成lncRNA PRNCR1的沉默表达的慢病毒载体的构建。慢病毒转染效率较高,以人肺腺癌细胞系A549细胞为试验对象,慢病毒转染率见图1。shRNA-lncRNA PRNCR1载体慢病毒转染滴度为3×108TU/ml。

A.荧光视野 B.白光视野图1 慢病毒干扰载体转染A549细胞结果 (×200)Figure 1 Lentivirus interference vector transfected A549 cells (×200)

2.2 凋亡因子Caspase-3,Caspase-9以及lncRNA PRNCR1基因的表达水平

空白对照组、阴性对照组和实验组的lncRNA PRNCR1的mRNA的相对表达量比较具有统计学差异(F=9.299,P<0.05,见图2),其中实验组lncRNA PRNCR1的mRNA的相对表达量要明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(q=3.997,P=0.017 9)。空白对照组、阴性对照组和实验组的Caspase-3 mRNA的相对表达量比较具有统计学差异(F=11.003,P<0.05),实验组Caspase-3 mRNA的相对表达量要明显高于阴性对照组,差异具有统计学意义(q=4.086,P=0.014 9)。空白对照组、阴性对照组和实验组间Caspase-9 mRNA的相对表达量比较具有统计学差异(F=9.001,P<0.05),实验组Caspase-9的mRNA的相对表达量要明显高于阴性对照组相比,差异具有统计学意义(q=3.172,P=0.021 4)。

2.3 凋亡因子Caspase-3,Caspase-9以及lncRNA PRNCR1的蛋白表达水平

Western blot检测结果显示,空白对照组、阴性对照组和实验组的lncRNA PRNCR1蛋白表达量比较具有统计学差异(F=9.087,P<0.05),实验组的lncRNA PRNCR1蛋白表达量要明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(q=4.129,P=0.022 4)。空白对照组、阴性对照组和实验组的Caspase-3蛋白相对表达量比较具有统计学差异(F=9.793,P<0.05),实验组Caspase-3蛋白表达量要明显高于阴性对照组,差异具有统计学意义(q=3.827,P=0.012 9)。空白对照组、阴性对照组和实验组的Caspase-9蛋白表达量比较具有统计学差异(F=9.998,P<0.05),实验组Caspase-9蛋白表达量要明显高于阴性对照组,差异具有统计学意义(q=3.911,P=0.027,见图3)。

与空白对照组和阴性对照组比较，* P<0.05图2 三组lncRNA PRNCR1基因、凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达水平比较Figure 2 Expression levels of lncRNA PRNCR1 mRNA, Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in three groups

与其他两组比较，* P<0.05图3 Western blot检测三组lncRNA PRNCR1、凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的蛋白表达水平Figure 3 Expression levels of lncRNA PRNCR1, Caspase-3 and Caspase-9 proteins in blank control group, negative control group and experimental group by Western blot

2.4 三组肿瘤细胞的迁移能力

Transwell试验结果显示,空白对照组中透过分子筛的细胞数为156.32 ±9.42,阴性对照组中透过分子筛的细胞数为149.12 ±8.57,实验组中透过分子筛的细胞数为66.81 ±7.56。三组之间比较差异具有统计学意义(F=24.847,P=0.019 8)。其中实验组与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(q=3.219,P=0.020 7)。

2.5 三组肿瘤细胞的凋亡水平

AV-PI检测结果显示,空白对照组细胞的凋亡率为(3.92 ±0.05)%,阴性对照组的凋亡率为(3.88 ±0.03)%,实验组的凋亡率为(9.12 ±0.01)%,三组比较差异具有明显的统计学意义(F=19.837,P=0.011 7)。实验组与阴性对照组比较差异具有统计学意义(q=3.221,P=0.020 1)。

3 讨论

恶性肿瘤作为威胁人类生存的重大公共卫生问题之一,极大地危害人类的健康。因此寻求恶性肿瘤的治疗靶点具有十分重要的研究意义[7,8]。lncRNA PRNCR1基因的表达与恶性肿瘤的侵袭性密切相关[9-11]。本研究聚焦于lncRNA PRNCR1基因在人肺癌中的表达,构建shRNA-lncRNA PRNCR1的慢病毒干扰载体,探究shRNA-lncRNA PRNCR1对肺癌增殖、侵袭和凋亡的作用机制。

Caspase-3是一种与细胞凋亡密切相关的蛋白酶,也被称作“死亡蛋白”,既往研究中均将Caspase-3与细胞凋亡相联系,作为细胞凋亡的指示分子[12-14]。Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,它们的一个重要共同点是活性位点都含有半胱氨酸,并特异地断开天冬氨酸残基后的肽键[15,16]。本研究通过RT-qPCR法检测了shRNA-lncRNA PRNCR1的慢病毒干扰载体在肺癌细胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9 mRNA水平的表达。实验组与空白载体病毒组相比,差异具有统计学意义。由此可见,shRNA-lncRNA PRNCR1在肺癌细胞的凋亡具有明显的促进作用,而这种促凋亡作用正是通过促进Caspase-3和Caspase-9的表达来实现的。另外通过蛋白水平Western blot的检测结果显示Caspase-3蛋白中实验组与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。Caspase-9的蛋白相对表达量实验组与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果显示从蛋白水平上再次证实了shRNA-lncRNA PRNCR1在肺癌细胞的凋亡具有明显的促进作用。

另外,本研究采用Transwell的实验方法检测肿瘤细胞的迁移,三组之间比较差异具有统计学意义。从结果中可以得出的结论是,shRNA lncRNA PRNCR1对肺癌细胞的迁移具有明显抑制的作用。最后,我们利用AV-PI凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡,三组比较差异具有统计学意义。从结果中可以得出的结论shRNA lncRNA PRNCR1对肺癌细胞的过度凋亡具有明显的促进作用。

然而本研究仍然具有一些缺点,本研究只是初步研究shRNA lncRNA PRNCR1对肺癌细胞的增殖、侵袭和过度凋亡具有明显的作用,但是其具体起作用的分子生物学机制还没完全明了,需要进一步的研究。