超声及超声靶向微泡破坏对表皮葡萄球菌生物膜的破坏作用

胡 健,张 宁,李 盼,何年安,王晓琴*

(1 西安交通大学第一附属医院检验科,西安 710061;2 西安交通大学第一附属医院转化医学中心;3 中国科学技术大学附属第一医院超声医学科;*通讯作者,E-mail:1493722680@qq.com)

近年来,随着临床上各类医疗植入性假体(如人工瓣膜、人工导管、血管支架或骨关节假体等)的广泛应用,伴随假体植入而并发的生物膜感染已成为一个棘手的临床问题。由于生物膜中的细菌相比浮游生长的细菌在生理状态、代谢水平及基因转录调控等诸多方面均存在着明显的差异,其针对抗生素及宿主免疫系统的耐受性均显著提高[1-3]。因此与医疗植入性假体相关的生物膜感染常在临床上形成难治性、持续性的感染,并最终导致医疗假体植入的失败,给患者造成巨大的痛苦和经济负担。

目前有研究表明,低功率的理疗级超声在对人体组织不产生任何损伤的同时,可增强多种药物或生物大分子在组织或细胞内的传递效率[4,5]。此外,低功率超声对与细胞结构完全不同的细菌同样具有一定的生物学作用,并可明显提高多种细菌对抗生素的敏感性[6,7]。抗菌药物联用超声已成为国际上治疗细菌生物膜感染的研究重点,尤其在口腔医学及关节医学领域已有关于超声(辅助抗菌药物)清除细菌生物膜的研究报道[8-10]。另外有研究表明，利用一种临床常用的超声造影剂“微泡”(microbubble)作为空化核可明显降低超声空化作用的阈值，并显著增强超声的生物学效应，微泡辅助下的超声辐照即“超声靶向微泡破坏”(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)比单纯超声能够显著提高真核细胞对大分子物质的摄取效率[11,12]。因此UTMD可能会对细菌及其生物膜产生更强的生物学效应，明显提高细菌及其生物膜对抗生素的敏感性。

本研究利用表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物膜作为模型,探讨超声及UTMD对生物膜可能产生的生物学作用,以期为利用超声及UTMD联合抗生素治疗医疗植入性假体相关的生物膜感染提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、主要试剂及仪器

生物膜阳性的表皮葡萄球菌菌株,从西安交通大学第一附属医院中心ICU住院治疗的患者体内植入的中心静脉导管中取样培养分离获得。细菌鉴定及药敏试验板卡购自法国梅里埃公司;TSB培养基购自英国OXOID公司;96孔/6孔细胞培养板购自美国CORNING公司;激光共聚焦专用培养皿购自美国WPI公司;2%结晶紫染料购自珠海贝索生物技术有限公司;细菌Live/Dead生存指示试剂盒购自美国Life Technologies公司;万古霉素购自美国Sigma公司;SonoVue超声微泡造影剂购自瑞士Bracco suisse SA公司。全自动细菌鉴定药敏分析仪购自法国梅里埃公司;激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司;Cosmogamma US13超声波理疗仪购自意大利爱美优公司。

1.2 表皮葡萄球菌生物膜的培养制备

用一次性使用采样棒挑取表皮葡萄球菌单克隆菌株,接种于TSB(标准浓度为30 g/L)培养基中,37 ℃,210 r/min,振荡培养过夜增菌。将过夜菌液用TSB培养基1 ∶200稀释后注入细胞培养板/皿中,37 ℃恒温静置培养16 h。弃去培养板/皿中的菌液,并用无菌生理盐水轻轻冲洗板底3次,以去除沉积但未附着于板底的细菌。培养板/皿底部附着的膜样细菌群落结构即为细菌生物膜。

1.3 肉眼及光镜观察表皮葡萄球菌生物膜形态

将获得于96孔/6孔细胞培养板中的表皮葡萄球菌生物膜自然晾干,甲醇固定10 min,倒掉甲醇,晾干,用2%结晶紫染色10 min。利用肉眼或在普通光学显微镜观察表皮葡萄球菌生物膜的形态。

1.4 激光共聚焦显微镜观察表皮葡萄球菌生物膜形态

于激光共聚焦专用培养皿(底部为玻璃材质)中培养获得表皮葡萄球菌生物膜,利用含有SYTO9(1 μmol/L)及PI(1 μmol/L)的Live/Dead细菌生存指示试剂盒对生物膜进行荧光染色,室温避光孵育30 min。用激光共聚焦显微镜观察表皮葡萄球菌生物膜形成情况。生物膜在激光共聚焦显微镜下以0.5 μm步进拍摄断层照片,再经三维重建获得生物膜的三维图像。

1.5 表皮葡萄球菌及其生物膜药物敏感性的测定

挑取过夜生长的表皮葡萄球菌单克隆,利用梅里埃VITEK 2 compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪测定该菌株的抗生素耐药谱及敏感抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。

生物膜对万古霉素的药物敏感性利用96孔板抗生素梯度生物膜杀伤试验测定，方法如下：将过夜培养的菌液用TSB培养基1 ∶200稀释，接种于96孔细胞培养板中，37 ℃恒温静置培养至6 h或12 h，以获得尚未成熟或已成熟的生物膜样本。弃去菌液，利用无菌生理盐水轻轻冲洗生物膜3次。并将含有系列浓度(200，100，50，25，12.5，6.25，3.13 μg/ml)万古霉素的无菌TSB培养基加入培养板。继续静置于37 ℃恒温培养12 h。弃去菌液，无菌生理盐水轻柔润洗板底3次后将培养板自然晾干。生物膜利用结晶紫或Live/Dead试剂盒染色后，分别利用肉眼及激光共聚焦显微镜观察生物膜是否生长。如高于某浓度的万古霉素可将已形成的生物膜彻底清除，则该浓度即为最低杀生物膜浓度。

1.6 超声或UTMD处理表皮葡萄球菌生物膜

在制备好的，附着有表皮葡萄球菌生物膜的培养板/皿中注入适量无菌TSB或含有特定浓度万古霉素的无菌TSB；UTMD处理需在此基础上再加入终浓度为30%(V/V)的超声造影微泡。于培养板/皿底部涂抹医用超声耦合剂使之与5 cm2的超声探头紧密贴合。超声理疗仪的功率设定为1 W/cm2，占空比50%，辐照时间10 min。处理后的生物膜于37 ℃培养箱中继续静置培养6 h。生物膜利用结晶紫或Live/Dead试剂盒染色后，分别利用光镜或激光共聚焦显微镜对生物膜的形态进行观察。

1.7 图像分析及数据统计

激光共聚焦显微镜拍摄得到的生物膜断层照片集利用Bitplane Imaris 7.0软件进行三维重构,从而获得生物膜的立体图像。生物膜各断层照片的荧光强度利用ImageJ2X 2.1软件进行定量分析。不同生物膜断层照片集的平均荧光强度比较利用配对样本t检验进行分析,统计软件为SPSS 19.0。

2 结果

2.1 表皮葡萄球菌临床菌株的药物敏感性

经全自动药敏分析,本研究分离获得的表皮葡萄球菌临床菌株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素、利福平、磺胺甲恶唑等多种抗生素耐药,对万古霉素敏感,MIC为1.0 μg/ml。

2.2 表皮葡萄球菌生物膜形成情况

该表皮葡萄球菌经过体外培养,能够在聚苯乙烯塑料(96孔/6孔细胞培养板)及玻璃(共聚焦皿)表面形成生物膜。生物膜经结晶紫染色后通过肉眼和光镜观察显示,其结构较为均一、致密;进而利用含SYTO9和PI的Live/Dead染液标记生物膜后,经激光共聚焦显微镜观察显示,生物膜中充斥着大量活细菌(标记为绿色),而死亡细菌(标记为红色)少见,生物膜的厚度约为10-15 μm(见图1)。

A.于96孔板中培养的生物膜经结晶紫染色后的肉眼下形态;B.生物膜经结晶紫染色后在20倍物镜下的形态;C.经Live/Dead染色后,由激光共聚焦显微镜拍摄的生物膜三维立体图像;绿色荧光标识存活细菌,红色荧光标识死亡细菌图1 表皮葡萄球菌临床菌株生物膜的形态Figure 1 The morphology of the biofilm from the clinical strain of S.epidermidis

2.3 生物膜的药物敏感性

在体外培养6 h并获得该临床菌株未成熟的生物膜样本后,向培养基中加入万古霉素,并继续培养12 h,只有浓度≥12.5 μg/ml(12.5倍MIC)的万古霉素方可完全清除已形成的未成熟生物膜。在体外培养12 h并获得该菌株成熟的生物膜样本后,向培养基中加入万古霉素,并继续培养12 h,即使浓度为200 μg/ml的万古霉素(200倍MIC)仍不能有效清除已形成的生物膜,且激光共聚焦显微镜显示此时生物膜的形态与未处理的生物膜无显著区别,生物膜中仍充斥着大量活细菌(绿色)(见图2)。提示该菌株成熟的生物膜对万古霉素高度耐药。

2.4 理疗超声对生物膜的影响

利用理疗超声探头以1 W/cm2功率(占空比50%)的超声波对该临床菌株培养12 h的生物膜处理10 min,可使生物膜的表面形成大量微小穿孔(光镜下可见),但共聚焦显微镜显示剩余生物膜中仍充斥大量活细菌。超声联和100 μg/ml万古霉素对生物膜共同进行处理,处理后的生物膜在光镜下形态与单用超声处理无显著区别,然而共聚焦显微镜下可见剩余生物膜中出现了更多的死细菌(红色荧光占总荧光比例显著提高,P<0.01,见图3,表1)。提示超声及超声联合万古霉素可对生物膜造成物理损伤。此外,超声联合万古霉素虽可杀死少量生物膜中的细菌,但生物膜中活细菌数量依然占优势。

A.于96孔板中培养的生物膜经结晶紫染色后的肉眼下形态;加入各孔的抗生素浓度标记在图片左侧;其中“6 h”表示预培养6 h的未成熟生物膜,“12 h”表示预培养12 h的成熟生物膜 .经Live/Dead染色后的生物膜的三维立体图像;绿色荧光标识存活细菌,红色荧光标识死亡细菌;“12 h/200 μg/ml”为预培养12 h的成熟生物膜,并加入了200 μg/ml的万古霉素

图2 表皮葡萄球菌临床菌株生物膜对万古霉素的敏感性
Figure 2 Sensitivity of the biofilm from clinical strain ofS.epidermidisto vancomycin

第一行图片为生物膜经结晶紫染色后在20倍物镜下的形态,第二行图片为生物膜经Live/Dead染色后利用激光共聚焦显微镜拍摄并重建的三维立体图像;绿色荧光标识存活细菌,红色荧光标识死亡细菌图3 超声及超声联合万古霉素对表皮葡萄球菌生物膜的影响Figure 3 Effects of ultrasound and ultrasound combined with vancomycin on biofilm from S.epidermidis

表1 超声及超声联合万古霉素处理后生物膜断层被SYTO9及PI标记的平均荧光强度Table 1 Mean fluorescence intensities of SYTO9 and PI labeled biofilm sections treated by ultrasound and ultrasound combined with

t,P值为PI/总荧光各组与未处理对照比较结果;与未处理对照比较,*P<0.01

2.5 UTMD对生物膜的影响

在上述相同的超声条件下,向超声体系中添加终浓度为30%(V/V)的超声造影微泡,对生物膜进行UTMD处理,可显著提高超声对生物膜的破坏作用,光镜下可见生物膜出现大片剥脱。但共聚焦显微镜显示剩余生物膜中仍充斥大量活细菌。UTMD联和100 μg/ml万古霉素对生物膜共同进行处理,其光镜下形态与单用UTMD处理无显著区别,然而共聚焦显微镜下显示剩余生物膜中充斥大量死细菌(红色荧光占总荧光比例显著提高,P<0.01,见表2),而活细菌(绿色荧光)少见(见图4)。提示UTMD对生物膜造成的物理损伤与超声相似,无法直接杀伤生物膜中的细菌,而UTMD与万古霉素联合则可对生物膜中的细菌造成显著杀伤。

表2 UTMD及UTMD联合万古霉素处理后生物膜断层被SYTO9及PI标记的平均荧光强度Table 2 Mean fluorescence intensities of SYTO9 and PI labeled biofilm sections treated by UTMD and UTMD combined with

t,P值为PI/总荧光值各组与未处理对照比较结果;与未处理对照比较,*P<0.01

第一行图片为生物膜经结晶紫染色后在20倍物镜下的形态,第二行图片为生物膜经Live/Dead染色后利用激光共聚焦显微镜拍摄并重建的三维立体图像；绿色荧光标识存活细菌,红色荧光标识死亡细菌图4 UTMD及UTMD联合万古霉素对表皮葡萄球菌生物膜的影响Figure 4 Effects of UTMD and UTMD combined with vancomycin on biofilm from S.epidermidis

3 讨论

临床植入性假体相关感染迁延不愈的重要原因是造成这种感染的治病菌形成了生物膜,从而对多种抗生素高度耐药。这种耐药性一方面与生物膜中的基质成分对细菌的保护性作用相关,亦可能与生物膜中细菌自身耐药性的提高有关。目前尚无药物或其他保守疗法可用于治疗假体相关生物膜感染,移除假体是治疗这种感染的唯一途径。

20世纪90年代,有研究发现,低功率的超声辐照能够在不损伤人体组织的前提下,可降低细菌对抗生素的耐药性,协助抗生素杀伤耐药菌。其中,超声对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌及沙门氏菌等革兰氏阴性细菌的作用尤为显著[13,14]。本世纪初,有研究进一步发现,超声不仅能影响细菌本身的耐药性,还对其形成的生物膜具有一定的杀伤作用。超声波可清除变形链球菌及粪肠球菌形成的生物膜[15,16]。此外,也有学者发现,超声波与抗生素联合可对细菌生物膜产生协同杀菌作用。超声联合庆大霉素或克林霉素可对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等生物膜中的细菌产生一定的杀伤作用[17-19]。近年来,越来越多的研究证实,超声可通过其产生的空化作用对细菌生物膜造成损伤,从而降低生物膜对抗生素的耐药性。有国外学者甚至启动了超声联合抗生素治疗生物膜感染的临床研究,并取得了一定的研究成果[8-10]。

本研究结果表明,利用低功率的超声辐照可对表皮葡萄球菌生物膜形成较为显著的物理损伤,使生物膜出现局部剥脱。但是,超声联合万古霉素直接杀伤生物膜中细菌的作用却并不显著。单纯的超声处理无法有效降低生物膜中细菌对万古霉素的耐药性,处理后的剩余生物膜中死菌的数量虽较未处理的生物膜有一定增加,但生物膜中仍有大量活菌存在。这一发现与部分文献的报道一致,超声对革兰氏阳性细菌的生物学作用较弱,其可能机制在于革兰氏阳性细菌与阴性菌的细胞壁结构不同[13]。

近年来,学者们发现,将超声与超声造影微泡联合使用,可在局部产生一种UTMD现象,并有效提升超声波对组织和细胞的声学作用,从而使超声发挥更显著的生物学效应。目前国际上已有学者开始关注其对细菌生物膜的影响。有报道指出,UTMD可提高β防御素-3对表皮葡萄球菌生物膜的杀伤活性[20]。本研究的前期研究也表明,UTMD联合万古霉素可对表皮葡萄球菌ATCC35984株的生物膜产生较超声联合万古霉素更为显著的作用,不仅能够使生物膜产生大面积的剥脱,还能有效杀伤剩余生物膜剥脱裂孔周边的细菌,但是UTMD联合万古霉素依然无法杀伤剩余生物膜中心部分的细菌[21]。

本研究挑选了一株表皮葡萄球菌临床多重耐药菌株作为研究对象,观察UTMD联合万古霉素对这一临床耐药菌株生物膜的作用。研究表明,UTMD联合万古霉素处理该临床菌株的生物膜,获得了较ATCC35984株更显著的效果,处理后剩余生物膜中充满了死亡细菌。上述结果提示,UTMD处理生物膜后,生物膜中细菌对抗生素的耐药性显著降低,从而促使抗生素更有效的杀伤细菌生物膜;但是针对不同菌株的表皮葡萄球菌,UTMD的处理效果可存在较大差异,UTMD对不同种类细菌生物膜的作用可能也不尽相似。

本研究提示超声理疗联用超声造影微泡所产生的UTMD作用,可有效降低细菌生物膜对抗生素的耐药性,增强抗生素杀伤生物膜的能力,UTMD联用抗生素相比超声联用抗生素可能更有希望在今后成为临床对抗医疗假体相关生物膜感染的一种治疗方法。