用于质谱分析的细胞总蛋白三种酶切方法比较

胡 家,杨 颖,李 蕾,殷爱红,李慎涛*

(1 首都医科大学中心实验室,北京 100069;*通讯作者,E-mail:lishentao@sina.com)

近几十年来,基于质谱技术的蛋白质组学有了长足发展[1,2]。样品制备是其中的一个重要环节,也是蛋白质组学发展的一个技术瓶颈[3,4]。在细胞水平上进行蛋白质组学研究时,通常包括一些必不可少的步骤,如收集细胞样品、细胞裂解、蛋白抽提、蛋白纯化、蛋白定量、蛋白酶切和蛋白样品脱盐等[2-9]。在细胞总蛋白提取过程中,通常需要加入去污剂[2],但在进行翻译后修饰研究时,去污剂会对富集修饰化多肽产生影响,也会对酶切效率产生影响,并且在质谱测试过程中极易离子化,在质谱图上显示出比多肽离子信号强度高得多的信号,从而对实际样品测试产生不良影响[3-7]。为了避免去污剂的影响,通常会在酶切之前加入很多去除去污剂的步骤,这不但费时费力,而且会导致一些疏水蛋白丢失[6,7]。

本研究比较了三种无去污剂的细胞总蛋白酶切样品制备方法,观察质谱对细胞总蛋白的鉴定情况。第一种方法:以聚丙烯酰胺凝胶制成的干胶粒作为介质,让干胶粒吸入收集的完整细胞样品,再进行胶内酶切,称为“细胞吸入胶内酶切法”[3];第二种方法:同样以干胶粒作为介质,将细胞的蛋白裂解液吸入干胶粒中,再进行蛋白胶内酶切,称为“蛋白吸入胶内酶切法”[3,7,10];第三种方法:以超滤膜作为辅助物的溶液酶切方法,称为“超滤管辅助溶液酶切法”(filter-aided sample preparation,FASP)[5]。

1 材料与方法

1.1 实验样品

293T细胞系,由本实验室提供。

1.2 主要试剂和仪器

尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)和碳酸氢铵为美国Sigma公司产品;10 kD超滤浓缩管为美国Millipore公司产品;胰蛋白酶为美国Promega公司产品;质谱级纯水、乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸为美国Fisher公司产品。NanoDrop微量分光光度计和SpeedVac真空干燥机为美国Thermo公司产品;Easy-Nano LC液相色谱仪和Triple TOF6600质谱仪为美国Sciex公司产品。

1.3 干胶粒制备

在1.5 ml EP管中依次加入25 mmol/L碳酸氢铵30 μl、丙烯酰胺/甲叉(30%,29 ∶1,W/V)16.7 μl、过硫酸铵(10%)2.5 μl和TEMED 0. 05 μl,轻轻混匀。待凝胶聚合之后,将其切成小块,用50%乙腈/50 mmol/L碳酸氢铵洗涤2次,用乙腈脱水2次。然后将胶粒放入真空干燥机中旋干,-20 ℃冻存备用。

1.4 293T细胞蛋白提取

按参考文献[11-13]的方法,在约2.6×106个细胞沉淀中加入5倍体积预冷裂解液[含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT和蛋白酶抑制剂],涡旋均匀,置于冰上裂解细胞2 h,期间在冰浴上超声破碎细胞(功率2 W、超声时间2 s、间歇2 s、20个循环),至细胞蛋白裂解液澄清。再将细胞蛋白裂解液于4 ℃、40 000g离心1 h,取离心上清、分装,一部分用于蛋白吸入胶内酶切法,余下用于后述的超滤管辅助溶液酶切法。

1.5 细胞吸入胶内酶切法

收集约105个细胞沉淀,重悬于30 μl预冷的含蛋白酶抑制剂的样品缓冲液(25 mmol/L碳酸氢铵,pH 8.0)中,混匀后加入干胶粒中,静置10 min,让干胶粒充分吸收样品,将样品分别置于-80 ℃冰箱和37 ℃水浴中剧烈冻融2次。分别加入50 μl 10 mmol/L DTT和30 mmol/L IAA,对样品进行还原和烷基化,然后用50%乙腈/50 mmol/L碳酸氢铵洗涤2次,用100%乙腈脱水两次,将胶粒放入真空干燥机中旋干。将胶粒置于冰上,加入50 μl 0.01 μg/μl胰蛋白酶(溶于25 mmol/L碳酸氢铵中)。酶切过夜后,对多肽产物进行两次抽提,第1次用5% TFA溶液加入胶粒样品中,37 ℃孵育30 min,再转移至超声水浴中超声5 min,将样品溶液移至一新管中;第2次用2.5%三氟乙酸/50%乙腈溶液加入胶粒样品中,37 ℃孵育30 min,再转移至超声水浴中超声5 min,取出样品溶液,并与第1次取出的样品混合,放入真空干燥机中旋干,冻存于-20 ℃。

1.6 蛋白吸入胶内酶切方法

取30 μl 293T细胞的蛋白裂解液加入干胶粒中,待胶粒完全吸收蛋白样品后,后续的处理过程同上述细胞吸入胶内酶切法。

1.7 超滤管辅助溶液酶切法

按参考文献[5]的方法,向30 μl 293T细胞蛋白裂解液中加入DTT至终浓度10 mmol/L,37 ℃孵育2.5 h,使样品中蛋白的二硫键处于打开状态,恢复至室温,加入碘乙酰胺至终浓度50 mmol/L,避光放置40 min,对打开的二硫键进行烷基化保护。将样品转移至10 kD超滤浓缩管中,10 000g、20 ℃离心30 min,在超滤管内管中加入200 μl含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)及8 mol/L尿素的溶液,10 000g、20 ℃离心30 min,重复本步骤2-3次。在超滤管内管中加入200 μl 50 mmol/L碳酸氢铵,10 000g、4 ℃离心30 min,重复本步骤2-3次。换1个新的超滤管套管,在内管中加入150 μl 50 mmol/L碳酸氢铵,按照总蛋白和胰蛋白酶50 ∶1的比例(体积比)加入酶液,37 ℃孵育16 h。10 000g、4 ℃离心30 min,加入100 μl 50 mmol/L碳酸氢铵,10 000g、4 ℃离心30 min,该步骤重复3次,收集多肽样品。向样品中加入终浓度1%的甲酸,冻干样品。

1.8 质谱检测

将酶切样品用A相溶液[含0.1%甲酸(W/W)和2%乙腈(W/W)]重溶后,经NanoDrop进行蛋白定量,18 000g离心10 min,取4 μl上清上样,进行纳升级液相与Triple TOF6600质谱联用分析。色谱柱:C18除盐柱(3 μm,120 Å,350 μm×0.5 mm)、C18分析柱(3 μm,120 Å,75 μm×150 mm),系统柱压小于6 000 Psi;流速0.6 μl/min;90 min分析梯度:0 min,5% B相溶液[含0.1%甲酸(W/W)和98%乙腈(W/W)];0-0.1 min,5% B相溶液;0.1-55 min,5%-22% B相溶液;55-70 min,22%-30% B相溶液;70-75 min,30%-45% B相溶液;75-76 min,45%-90% B相溶液;76-81 min,90% B相溶液;81-82 min,90%-5% B相溶液;82-90 min,5% B相溶液。质谱条件:ESI源、正离子扫描模式、喷雾电压2.3 kV、离子源温度150 ℃。蛋白鉴定质谱扫描模式:一级全扫描,范围m/z350-1 500;二级挑选40个丰度高的前体离子进行CID动态碎裂;扫描范围m/z100-1 500,动态排除扫描,动态排除时间15 s。

1.9 数据处理

用SCIEX提供的搜索引擎“Protein Pilot Software 5.0”对液质联用数据进行搜库,使用Uniprot Homo sapiens(Human)数据库(更新于2016年8月),设置一级质量偏差10 ppm、二级质量偏差20 ppm,胰蛋白酶酶切,半胱氨酸碘乙酰胺烷基化。获得置信度较高(假阳性率,FDR<1%)的鉴定结果。通过韦恩图(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对三种方法所得蛋白种类进行分析。采用Uniprot网站(https://www.uniprot.org/uploadlists/)对所鉴定到的蛋白匹配到UniProtKB IDs,对匹配上的蛋白进行Gene Ontology分析。

2 结果

2.1 细胞总蛋白酶切后多肽样品液质联用检测结果

将三种方法所得细胞总蛋白酶切多肽样品分别上样,液质联用所用方法一致,液相所得色谱图见图1。三种酶切方法所得样品蛋白鉴定结果见表1。

从色谱图可看出,对于细胞吸入胶内酶切法和超滤管辅助溶液酶切法制备的样品,液相梯度设置合理,多肽样品在整个梯度时间内均有流出(见图1A、C)。而对于蛋白吸入胶内酶切法制备的多肽样品,只在前55 min有机相浓度低于30%时出峰,后面高有机相时很少有肽段流出(见图1B),说明在样品制备过程中疏水性肽段丢失严重。由表1的鉴定蛋白数也可看出细胞吸入胶内酶切法及超滤管辅助溶液酶切法明显优于蛋白吸入胶内酶切法。

2.2 三种酶切法所得样品鉴定蛋白韦恩图分析

将三种酶切法所得样品鉴定的蛋白进行在线韦恩图分析(见图2),显示不同酶切方法得到的蛋白种类均有差异,即使鉴定数较少的蛋白吸入胶内酶切法,最后鉴定到的蛋白也有421种是另两种方法未鉴定到的。虽然酶切过程可能丢失了部分蛋白,但该方法仍检测到部分用其他方法未鉴定到的蛋白。由于蛋白质种类繁多、理化性质各异,要想实现对细胞全蛋白质组的深度覆盖,需要能规避蛋白提取的偏好性以及实验流程中样品的丢失问题[2]。

2.3 两种较优酶切方法所得样品鉴定的蛋白Gene Ontology分析

对两种鉴定蛋白数较多的酶切方法所鉴定到的全部蛋白进行Gene Ontology分析,采用细胞吸入胶内酶切法制备的样品共鉴定到3 835个蛋白,其中3 826个蛋白可进行GO分析,采用超滤管辅助溶液酶切法制备的样品共鉴定到4 248个蛋白,其中4 233个蛋白可进行GO分析。细胞定位分析结果表明:在细胞定位趋势上,两种酶切方法所制备样品的蛋白鉴定结果较为一致,超滤管辅助溶液酶切法制备样品所鉴定的蛋白总数略多,总蛋白在细胞定位之后,大多类蛋白数目也略多于细胞吸入胶内酶切制备的样品,但细胞吸入胶内酶切法却鉴定到了更多的膜组分相关蛋白(见图3),提示该方法能获得更多膜结合蛋白。

表1 三种酶切方法所得多肽样品液质联用鉴定蛋白数、多肽数及谱图数Table 1 The proteins,peptides,spectra identified by LC-MS/MS from the samples prepared by three digestion methods

蓝色线表示一级TIC,紫色线表示二级TIC图1 三种酶切方法所得多肽样品液相总离子流图Figure 1 Total ions chromatogram(TIC) of peptides obtained by three digestion methods

cell-absorb:细胞吸入胶内酶切法;pro-absorb:蛋白吸入胶内酶切方法;FASP:超滤管辅助溶液酶切法图2 三种酶切法所得样品鉴定蛋白的韦恩图Figure 2 Venn diagram analysis of proteins identified from samples prepared using three digestion methods

图3 两种酶切法鉴定蛋白GO分类Figure 3 The GO analysis of proteins identified from samples prepared by the two digestion methods

3 讨论

此三种酶切方法均未使用去污剂,因此避免了去污剂的种种弊端。就全细胞的蛋白鉴定整体性而言,需要鉴定到越多蛋白越好,所以超滤管辅助溶液酶切法和细胞吸入胶内酶切法更优,后一种方法在鉴定多肽数及平均匹配肽段数上更胜一筹,这对于一些需要覆盖更多肽段来确定某些修饰位点的蛋白鉴定更为有利。

对于同是以干胶粒作为介质的两种酶切方法,细胞吸入胶内酶切法经过反复冻融破碎细胞,未加入变性剂,许多蛋白会以蛋白复合体的形式进入凝胶碎片中。因为凝胶中蛋白复合体的分子质量更大,且有一定的空间结构。在用梯度乙腈洗涤凝胶的时候,蛋白复合体会比蛋白更容易被保留,所以细胞吸入胶内酶切法制备样品蛋白不易丢失[3]。而蛋白吸入胶内酶切法制备的多肽样品疏水性肽段丢失严重,这可能是因为蛋白提取过程中经过变性之后,长链蛋白分子不容易进入凝胶,一些蛋白在用梯度乙腈洗涤的时候丢失了。这在液质上样前多肽样品经NanoDrop进行蛋白定量时也有所体现,相同量的蛋白裂解液进行蛋白吸入胶内酶切后得到的多肽量不足1 μg,而采用超滤管辅助溶液酶切后得到多肽量为29.1 μg,多次实验均为类似结果(结果未展示)。文献中采用的蛋白吸入胶内酶切法未见蛋白丢失现象,可能是其蛋白抽提过程使用了去污剂SDS所致[3,7,10]。本实验用的变性剂是尿素,裂解出的蛋白种类和数量可能会有不同,在被干胶粒吸收后进入凝胶的深浅也会不同,在洗涤胶粒的过程中,一些未进入凝胶深层的疏水性蛋白更易被乙腈洗脱掉,这种推测有待于进一步实验验证。