内毒素耐受相关基因的生物信息学分析

陈 雪,胡迎春,钟 武*

(1 西南医科大学临床医学院急诊医学教研室,泸州 646000;2 西南医科大学附属第一医院急诊科;*通讯作者,E-mail:zhongwu2876@sina.com)

脓毒症是机体对感染的反应失调,其主要表现为炎症的爆发、机体的免疫抑制,以及最后的器官功能障碍,该疾病的死亡率达30%左右[1,2]。目前关于该疾病的机制研究非常多,而内毒素耐受就是其中一个至关重要的分支。从脓毒症患者血液中分离出来的单核巨噬细胞表现出了对于炎性刺激的一种低反应状态,其主要表现为相关炎症因子的产生减少和HLA-DR的表达减少,这种现象就被称之为内毒素耐受[3]。内毒素耐受最开始被定义为在受到低剂量内毒素的预先刺激之后,对于随之而来的大剂量的内毒素刺激的一种耐受的状态[4],这一现象是在1947被Besson等首先报道的,他们利用在动物体内反复注射细菌内致热源的方法,观察到了实验动物对致热源发生的发热反应逐渐减低的现象。目前关于内毒素耐受现象的机制研究主要停留在TLR4信号通路相关的免疫调节[6-8]、免疫细胞的凋亡[9,10]、miRNA调节基因的表达[11-13]、免疫细胞的重编程[14,15]等方面。但这些研究并不能对内毒素耐受的发生、发展做出全面的解释。

在大数据发展的今天,生物信息学技术在医疗研究中的运用越来越广泛,我们利用基因芯片数据库,找到脓毒症与内毒素耐受相关的数据信息,并通过相关的网络平台及软件进行数据处理,寻找各种分散模块之间的内在联系,让我们对内毒素耐受相关的核心基因及脓毒症产生和发展的内在机制有了更加清晰的认识。

1 材料与方法

1.1 数据材料

以“LPS TOLERANCE”为检索关键词在GEO数据库检索获得芯片数据GSE8621,并抽取了其中内毒素耐受及脓毒症相关的样本各3个进行数据处理。该芯片的实验组是使用了低剂量LPS(脂多糖)预刺激的raw264.7细胞,随后实验组和对照组都使用了高剂量的LPS刺激以形成脓毒症模型[16]。

1.2 差异基因筛选

将数据提交到GCBI(https://www.gcbi.com.cn)平台,通过该平台对原始数据进行标准化预处理,随后进行样本分组,分为了脓毒症组和耐受组,并设置筛选差异表达基因参数:P<0.05,FC>1.5。

1.3 GO分析及KEGG分析

GO(http://www.geneontology.org/)是用于标准化基因及其产物而建立的数据库,将筛选出的差异表达基因提交于该网站,采用Goatools软件对筛选出的差异基因集进行GO富集分析,使用Fisher精确检验,并采用Bonferroni方法对P值进行校正,P<0.05时,可认为该GO功能存在显著富集情况,基于GO数据库进行功能分类,以确定两样本之间的差异基因主要参与了哪些生物学进程,并找到较为关键的几个生物学功能。KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)能系统地分析基因功能并将基因组信息与功能信息相联系,利用此数据库,可将基因集中的基因按照参与的通路或行使的功能分类,用到的软件是IPA,同样使用了Fisher精确检验并使用BH(Benjamini and Hochberg)法对P值进行校正,使P<0.05。将差异基因提交到KEGG数据库,找到本实验筛选出的差异基因主要集中于哪些信号通路,从而找到与内毒素耐受关系最为密切的信号通路。

1.4 共表达分析

是基于基因表达的相似程度而进行的模块分类,使用R软件包进行WGCNA(权重共表达网络分析,https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/),生成纯文本文件,再利用Cytoscape软件进行可视化的共表达网络的构建,从而找到各差异基因表达值的相关性,直观地发现处于核心部位的基因,为进一步的研究提供依据[17]。

1.5 蛋白质相互作用网络

蛋白质作为细胞分子生物系统的基本结构原件,蛋白质之间的相互作用,是细胞发挥功能的关键,将芯片数据提交到STRING(https://string-db.org)在线平台以构建蛋白质相互作用网络,该平台是将现存研究中的生物分子相互作用网络、高通量表达数据及其他分子状态整合为一个统一框架[18],获得蛋白互作网络关系后,利用Python下的networkX对感兴趣基因进行网络可视化,以帮助了解差异基因之间的相互关系和蛋白质的生物功能,对疾病发生发展的机制进行更加深度的剖析[19]。

2 结果

2.1 差异基因的筛选结果

通过对GSE8621的芯片数据进行分析,从脓毒症与内毒素耐受这两个分组中共筛选出了2 584个差异基因(P<0.05),与脓毒症组相比,内毒素耐受组中有1 618个下调基因、966个上调基因(见图1)。由差异基因聚类分析可知,本研究筛选出的差异基因可以明显地区分出脓毒症组与内毒素耐受组(见图1)。

图中纵列代表每个样本芯片,横坐标代表每个基因的表达值,红色代表该基因在样本中是上调的,绿色代表该基因在样本中是下调的,颜色深浅与基因的上下调程度呈正比图1 差异表达基因的聚类分析Figure 1 Cluster analysis of differentially expressed genes

2.2 差异基因GO富集分析结果

对差异表达基因进行GO功能富集分析,结果表明差异表达基因主要参与了细胞转录的调节、细胞的凋亡以及蛋白质的磷酸化。其中排在前10位的生物学功能分别是:①细胞凋亡;②磷酸化;③转录的负调节(DNA依赖性);④凋亡过程的负调节;⑤转录的正调节(DNA依赖性);⑥蛋白质磷酸化;⑦RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调节;⑧RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节;⑨转录;⑩DNA依赖的转录调节(见图2)。

2.3 差异表达基因KEGG通路富集分析

筛选出的2 584个差异基因富集于160条信号通路网络中,其中最为突出的有:代谢相关通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、肿瘤相关信号通路、Jak-STAT信号通路、NF-kB信号通路、TLRs信号通路(见图3)。

2.4 共表达分析

以差异基因表达谱的相似性为基本标准,构建了基因共表达网络,并找到位于网络枢纽位置的基因作为其核心基因。可以看出基因:Pik3r2、Nfkb1、Plcg2、Gnai3、Rac3、Src均位于网络的核心位置,其有望成为内毒素耐受的关键基因(见图4)。

2.5 蛋白质相互作用网络模块

将差异基因上传至STRING在线网络平台,用以分析差异基因所表达的蛋白之间的相互作用,并构建出蛋白质相互作用的网络模块,基因Src、Rnd1、Edn1、Socs3、Il10等表达的蛋白处于网络模块的核心位置(见图5)。

图2 差异表达基因的GO功能富集分析Figure 2 GO functional enrichment analysis of differential expression genes

圆点表示基因,连线越多面积越大,红色表示上调,蓝色表示下调图4 差异基因的共表达分析Figure 4 Co-expression analysis of differential genes

每个节点代表相应的蛋白,节点间的连线代表蛋白间存在相互作用图5 差异蛋白的相互作用网络图Figure 5 Differential protein interaction network diagram

3 讨论

脓毒症最初的表现多为炎症爆发、失控,紧接着机体就处于一种免疫抑制状态,对于进一步的刺激呈现出反应低下的状态,这也是重症监护室中脓毒症患者死亡率一直居高不下的原因之一,迅速采集这些患者的血液样本,分析发现包括CD4+和CD8+T细胞,B细胞和树突状细胞等细胞在内的免疫细胞处于一种凋亡诱导的状态,其数量也明显低于正常水平[20]。在内毒素耐受的巨噬细胞中存在着基因转录混合变异的现象,这种现象被称之为巨噬细胞重编程[21],这种重编程还与巨噬细胞极化现象有着密切的关系[22]。GO功能注释分析结果表明,我们筛选差异基因参与的生物进程主要与转录的调节、细胞的凋亡以及蛋白质的磷酸化相关。

近年来关于TLR家族与脓毒症之间的关系,主要集中在脓毒症免疫抑制这一方面,而产生内毒素耐受的机体也表现出一种对炎症刺激低反应的免疫抑制状态,TLRs是机体发生炎症反应的关键因子,TLRs家族中的成员在脓毒症的发生发展中扮演着重要的角色[23],同时TLR4在内毒素耐受中呈现出活化状态并且与其下游的MAPK通路产生级联反应,从而抑制了MAPK信号通路与NF-κB信号通路,TLR4途径的激活还可以改善组织器官的炎症损伤[24-27]。LPS可激活PI3K/AKT通路,该通路调节细胞因子和趋化因子的表达,同时它还通过抑制TLR4信号通路来参与内毒素耐受[28]。

在差异基因共表达分析网络中,NF-κB1处于网络的枢纽位点,且先前的研究也证实了NF-κB的P50(NF-κB1)亚基的表达水平与脓毒症相关炎症因子TNF-α的产生呈负相关,并在内毒素耐受的产生过程中起到了一定的作用[29]。Src家族激酶参与细胞信号传导的许多方面[30],Src家族激酶Lyn能够负性调节TLR信号的转导,在内毒素耐受状态下,Src的磷酸受到了抑制[31],同时在蛋白质相互作用网络模块中Src基因也是处于网络的核心位置,与之关联的基因数量最多,尽管现有的研究从不同的方面揭示了该基因与内毒素耐受及脓毒症之间的关系,但是并未有统一的意见出现,因此需要我们进一步的研究。

Socs3的表达依赖于JAK/STAT途径的调控,Noh等[32]利用IDO+/+与IDO-/-小鼠模型验证了血小板活化因子(PAF)可以通过调节Socs3的IDO-和JAK/STAT依赖途径来介导产生内毒素耐受,Il10的表达也与之相关,这与我们的KEGG通路分析及STRING蛋白质相互作用网络分析的结果是一致的。

总之通过生物进程、功能通路、基因共表达、蛋白质相互作用等一系列的数据分析方式,我们找到了许多与内毒素耐受的发生机制关系密切的生物因子,部分因子已经被证实与内毒素耐受的发生机制相关,还有部分生物因子并未出现在内毒素耐受相关的文献报道中,这或许可以为我们探究内毒素耐受的内在机制及脓毒症的预防和治疗提供新的方向。