基于生物信息学分析筛选参与IgA肾病的关键基因和通路

金美玲,邱 强,徐 晨,李 新,张 敏,张伟光,李典耕,赵素梅*

(1 首都医科大学附属北京朝阳医院肾内科,北京 100020;2 解放军总医院肾科;*通讯作者,E-mail:zhaosumei1998@126.com)

IgA肾病是全球特别是中国最常见的肾小球疾病,约占原发性肾小球疾病的45%,20% -40%的IgA肾病患者确诊后10-20年进展至终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)[1]。目前认为IgA肾病病因是免疫复合物介导的免疫炎症反应,由IgA1免疫复合物在肾小球系膜沉积引起的,主要表现为肾小球系膜细胞增殖及系膜基质积聚[2]。虽然在基础/临床研究方面,IgA肾病取得一定的研究进展,但对于IgA肾病的具体发病机制尚不能明确。近年来,基于高通量测序平台的基因表达分析在研究疾病的发生发展相关机制及分子诊断方面发挥了重要作用,且得益于公共数据库的建立,多种人类疾病的芯片检测结果可以在公共数据库中检索到,基于这些公开的芯片检测结果,由于数据注释结果的不断更新,不仅可以对芯片数据进行重新分析得到新的分析结果,也可以将多个芯片结果进行整合分析得到更为全面的分析结果,此类研究属于生物信息学范畴,生物信息学是将生命科学与计算机科学相结合的科学,利用计算机信息技术挖掘与生物过程相关的基因/通路,近几年此类研究发表较多[3]。在本研究中,我们对基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)公共数据库中IgA肾病患者及正常对照者的血液和肾小球组织的芯片检测结果进行重新注释分析,旨在研究参与IgA肾病发生的关键通路/基因,以期深入了解IgA肾病发生机制、筛选用于诊断/预后评估IgA肾病的分子诊断标志物。

1 方法

1.1 数据来源

从GEO公共数据库中下载GSE73953和GSE93798芯片检测结果,GSE73953为IgA肾病患者(15例)和正常对照者(2例)的外周血白细胞基因表达谱,GSE93798为IgA肾病患者(20例)和正常对照者(22例)的肾小球肾组织基因表达谱。

1.2 筛选差异表达基因

应用Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在线分析工具对上述两个芯片结果进行分析,对IgA肾病组和正常对照组的各个基因表达值通过t检验筛选P<0.01、高表达/低表达的1 000个基因,然后取交集。

1.3 差异表达基因的富集分析

基因本体(gene ontology,GO)分析是对基因及基因产物进行注释,识别生物学特性[4]。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析是将基因组信息与高阶功能信息联系起来,系统分析基因功能[5]。DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)是进行基因富集分析的常用数据库,我们应用DAVID在线工具对筛选的差异表达基因进行GO和KEGG分析[6],P<0.05为差异具有统计学意义。

1.4 蛋白互作分析

检索相互作用基因的搜索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)数据库用来分析蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI),我们将差异表达基因输入到STRING在线工具中,筛选combined score>0.4的互作蛋白。然后将得到的PPI结果输入到Cytoscape软件中,通过分子复合物检测(molecular complex detection,MCODE)分析模板筛选关键基因,即MCODE scores>3,数量>4,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选差异表达基因

应用Morpheus分别对GSE73953和GSE93798数据进行分析,取1 000个上调差异表达基因和1 000个下调差异表达基因,两组差异表达基因取交集,结果示外周血共筛选出1 804个差异基因、肾小球组织筛选中2 000个基因,其中184个基因为共有的差异表达基因(见图1),以下将对这184个差异表达基因进行分析。

图1 IgA肾病患者外周血及肾小球组织差异表达基因情况Figure 1 Differentially expressed genes associated with IgA nephropathy in PBMCs and glomerular tissues

2.2 GO富集分析和KEGG分析

应用DAVID在线工具对这184个差异表达基因进行GO和KEGG分析,GO分析结果(见表1)提示:①生物过程:差异表达基因显著富集于细胞外基质形成、细胞外结构形成、凋亡过程调节、程序性死亡调节、细胞死亡调节等;②细胞组成:差异表达基因显著富集于细胞外区域部分、胞外区、蛋白质细胞外基质、细胞外隙、细胞外基质成分等;③分子功能:差异表达基因显著富集于分子功能调节、酶调节活性、大分子复合物结合、蛋白激酶调节活性、激酶调节活性等。KEGG分析结果提示差异表达基因显著富集于局部黏附、Fc-r介导的吞噬作用、ECM-受体相互作用、MAPK信号通路、白细胞跨内皮迁移等通路(见表2)。

表1 IgA肾病相关184个差异表达基因的GO分析和KEGG分析结果Table 1 Gene ontology analysis and KEGG analysis of differentially expressed genes associated with IgA nephropathy

GO:基因本体分析;BP:biological process生物过程;CC:cellular component细胞组成;MF:molecular function分子功能;KEGG:京都基因与基因组百科全书分析;P为t检验P值

表2 IgA肾病相关关键基因群的KEGG分析Table 2 KEGG analysis of key differentially expressed genes associated with IgA nephropathy

2.3 蛋白互作分析筛选关键基因

通过STRING数据库对184个差异表达基因进行蛋白互作分析(见图2),结果提示中枢节点最高(即关键基因)为PTPRC、FN1、PECAM1、AGTR1、POSTN、AGT、COL4A1、TP53、CYR61、MGAM。使用Cytoscape的MCODE模块对STRING的蛋白互作结果进行分析筛选关键基因群,最显著的基因群见图3,富集分析提示这个基因群主要富集于肾素-血管紧张素系统等通路。

3 讨论

IgA是我国最常见的原发性肾小球肾炎类型,是导致CKD、ESRD的重要病因,深入研究IgA肾病的分子机制对于IgA肾病的诊断和治疗具有重要意义。近几年随着芯片技术和高通量测序的不断发展,可以同时获得人类基因组中数千个基因的表达水平,结果将有益于筛选疾病的诊断标志物及靶向治疗分子。目前认为IgA肾病是多种途径参与的自身免疫炎症相关性疾病,在IgA肾病患者肾脏免疫病理发现有免疫球蛋白和补体在肾小球系膜沉积[7,8],在动物实验中动物模型可由慢性血清病引起,说明循环免疫合物在肾小球沉积可能是病因之一[9],另外抗Thy1肾炎大鼠模型中,抗体直接与系膜细胞膜上的固有抗原反应形成免疫复合物而致病[10],综上IgA肾病是机体异常的免疫炎症反应引起的免疫复合物在肾脏肾小球基底膜沉积诱导系膜活化、增殖引起IgA肾病发生。

图2 184个差异表达基因蛋白互作结果Figure 2 Protein-protein interaction of 184 differentially expressed genes

图3 IgA肾病相关关键差异表达基因蛋白互作结果Figure 3 Protein-protein interaction of key genes associated with IgA nephropathy

本研究的亮点在于利用疾病公共数据芯片结果,整合不同研究的芯片结果,对比分析IgA肾病患者和正常对照者的血清和肾脏组织基因表达,筛选出的公共差异基因可能是参与IgA肾病发生发展的关键基因,可为后续机制研究提供方向,对这类目标基因进行研究不仅可以从机体整体角度深入了解IgA肾病的发生发展机制,也可成为IgA肾病血清分子诊断标志物。

基于以上基础,我们在GEO公共数据库中检测关于IgA肾病相关芯片结果,筛选出GSE73953(IgA肾病患者和正常对照者外周血细胞基因表达谱)和GSE93798(IgA肾病患者和正常对照者肾小球基因表达谱)芯片结果作为研究对象,首先应用Morpheus分析得到外周血细胞和肾小球的差异表达基因,通过取交集得到184个外周血细胞和肾小球共有的差异表达基因,这184个差异表达基因可以认为是可能参与IgA肾病发生发展的关键基因,通过对184个差异表达基因的富集分析,我们可以了解184个差异表达基因参与IgA肾病的途径/通路,GO分析中生物过程和细胞组成富集分析结果提示184个差异表达基因可能通过影响细胞外基质/结构及细胞凋亡/死亡发挥作用,KEGG通路分析结果提示184个差异表达基因显著富集于局部黏附、Fc-r介导的吞噬作用、ECM-受体相互作用、MAPK信号通路、白细胞跨内皮迁移等通路。既往研究发现局部黏附途径参与炎症、纤维化、迁移、有丝分裂等过程,结缔组织生长因子可以通过溶解局部黏附复合物激活细胞极化进行刺激系膜细胞迁移[11],免疫复合物通过Fc-受体Ⅰ和Ⅲ刺激系膜细胞产生Ⅳ型胶原等细胞外基质[12],系膜细胞ECM异常是IgA肾病发生发展的重要因素,对于促进系膜细胞增殖、迁移、细胞外基质表达及炎症浸润发挥重要作用[13]。MAPK是参与IgA肾病发生发展的经典通路,PDGF-BB、TGF-β、Ang-Ⅱ、IgA等是经典的系膜细胞活化因子,PDGF-BB通过MAPK通路诱导系膜活化,IgA1免疫复合物介导激活MAPK/ERK通路,促进系膜细胞增殖,引起IgA肾病肾小球损伤,新近发现的刺激因子也大多通过MAPK通路诱导系膜细胞增殖[14,15],因此MAPK通路在系膜细胞活化/增殖过程中起重要作用,白细胞跨内皮迁移途径对于诱导炎细胞浸润及促进炎症发生发展具有重要作用。总结差异表达基因的富集分析结果,我们猜测某种因素诱导机体免疫炎症反应可能通过影响肾小球系膜细胞的细胞外基质/结构、细胞凋亡/死亡、细胞黏附,介导炎细胞浸润,通过MAPK等通路参与IgA肾病发生发展过程。我们又进一步对184个差异表达基因进行蛋白互作分析,筛选IgA相关的关键基因,结果发现前10个关键基因为PTPRC、FN1、PECAM1、AGTR1、POSTN、AGT、COL4A1、TP53、CYR61、MGAM。这些基因与IgA肾病关系的研究较少，可能为IgA肾病发生新的基因，这不仅为我们深入研究IgA肾病的发生机制提供方向,也可能成为IgA肾病潜在分子诊断标志物。同时,我们使用Cytoscape的MCODE模块对STRING的蛋白互作结果进行分析筛选关键基因群,筛选出最显著的基因群(包括24个基因),这些基因显著富集于肾素-血管紧张素等通路,结果也间接证明ACEI/ARB类药物对于IgA肾病的治疗是有益处的。

综上所述,通过对IgA肾病基因芯片进行重新注释、整合分析,有助于深入研究IgA肾病的发生发展作用机制,筛选的关键基因可能成为干预IgA肾病的靶点,并可成为评估IgA肾病诊断和预后的潜在分子诊断标志物。