Flotillin-1在结肠癌中表达的初步研究

张畅 ，张佩云 ，鞠九妹 ，杨镇旗 ，方锦玲 ，钟凤梅 ，方贤磊 ，谢柳

1.湖南医药学院医学院，湖南怀化 418000；2.湖南医药学院第一附属医院病理科，湖南怀化 418000

结肠癌（colorectal cancer）是常见的消化系统的恶性肿瘤，仅次于胃癌和食管癌[1]。在我国，因恶性肿瘤死亡原因中，男性排在第五位，女性排在第6位，且近20年间发病率逐渐上升，男女比例约为2∶1[2]。其病因可能涉及环境因素、化学致癌物作用及基因的遗传和表观遗传学变异等多个因素。

Flotillins/Reggies家族最早发现于金鱼视网膜神经节细胞中，是一类高度保守并广泛表达的蛋白，在果蝇和人等多种生物中存在，有两个成员，分别为Flotillin-1（Flot1）和 Flotillin-2（Flot2）[3]。Flotillins蛋白主要定位于细胞膜胞质侧，同时广泛存在于多个细胞器内，不含跨膜结构域，通过豆蔻酰化和多个位点的棕榈酰化与细胞膜内侧相连[4]。Flotillins蛋白是细胞膜的重要组成部分，存在于细胞膜的脂筏结构上，参与跨膜物质转运、轴突再生、淋巴细胞分化和维持脂筏及细胞粘附等多种生理功能[5-6]。大量的研究发现Flotillins作为脂筏上的支架蛋白，参与多种信号通路的调节，且在多种肿瘤中高表达。曹传林等[7]收集了2015年5月手术的16例新鲜胃癌及癌旁组织标本，发现Flot1在RNA和蛋白水平均表达上调；2007年1月—2008年6月手术的187例石蜡标本，Flot1也表达上调，且与肿瘤浸润、淋巴结转移和临床分期有关[7]。Ou YX等[8]总结了包括2 473各病例的13项研究结果，发现Flot1在各种实体肿瘤中表达与肿瘤的进展和患者的预后相关。Yang Q等[9]则发现细胞骨架蛋白4.1N可以通过抑制Flot1/β-catenin/Wnt信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和转移，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从该院病例中选取结肠癌病例34例，非肿瘤性结肠疾病病例14例手术标本，该研究经过湖南医药学院第一附属医院伦理委员会批准，患者或家属知情同意。其中男性33例，女性15例，平均年龄55.7岁（44～78岁）。根据术后病理诊断及是否有淋巴结转移，分为非肿瘤组14例，结肠癌无淋巴结转移组21例（简称非转移组），结肠癌发生淋巴结转移组13例（简称转移组）。所有标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，制成4 μm厚切片备染。

1.2 免疫组化染色

应用免疫组化SP法进行检测，所采用的试剂Flotillin-1多克隆抗体购自proteintech公司、枸橼酸盐抗原修复液（pH6.0）、DAB显色液及PBS缓冲液均购自迈新公司。每个组织切片，经脱蜡、枸橼酸盐抗原修复液热修复，过氧化氢、牛奶封闭后滴加一抗（1∶200）4℃过夜。 复温后滴加二抗，37℃孵育 30 min，滴加HRP标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育3 min，最后DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。

1.3 结果判定

每张切片随机选取10个40×10倍视野，每个视野计数100个腺上皮细胞，取平均值。Flotillin-1主要位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色。阳性细胞比例=0%，1%～5%，6%～15%，＞15%，分别为“-，+，++，+++”。 结果统计时，以“-”和“+”为低表达，“++”和“+++”为高表达。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。计数资料[n（%）] 采用 χ2检验和 Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Flotillin-1在结肠癌病例中高表达

在34例结肠癌组织中，Flotillin-1的阳性高表达率为58.8%（20/34）。在14例非肿瘤性结肠疾病标本中，Flotillin-1 的阳性高表达率为 14.3%（2/14）。Flotillin-1主要表达在结肠腺癌细胞的细胞膜和细胞质中，呈浅黄色或棕黄色（图1）。统计分析Flotillin-1在结肠癌和非结肠癌标本中的表达差异有统计学意义（P<0.05）（表 1）。

2.2 Flotillin-1与结肠癌淋巴结转移密切相关

图1 结肠癌与非结肠癌标本中Flot1表达

表1 结肠癌与非结肠癌中Flot1表达

在34例结肠癌组织中，分为非转移组21例和转移组13例。其中非转移组中，Flotillin-1在癌组织中阳性高表达率为38.1%（8/21）（图2），淋巴结中阳性高表达率为0.0%（0/21）；转移组中，Flotillin-1在癌组织中阳性高表达率为92.3%（12/13），淋巴结（转移癌巢）中阳性高表达率为76.9%（10/13）（图3）。采用Fisher确切概率法检验分析Flotillin-1在发生淋巴结转移的结肠癌和未发生淋巴结转移的结肠癌标本中的表达差异有统计学意义（P<0.05）（表2,3）。

图2 转移组与未转移组癌组织中Flot1表达

表2 转移组与非转移组癌组织中Flot1表达

图3 转移组与未转移组淋巴结中Flot1表达

表3 转移组与非转移组淋巴结中Flot1表达

3 讨论

结肠癌由于早期症状不明显，起病隐匿，多数患者发现是已经是中晚期，部分甚至已经出现远处转移，丧失了手术治疗的最佳时期，导致患者的预后较差。因此，需要对结直肠癌转移的具体机制进行深入的研究并探究其具体机制，寻找有效的靶向药物作用位点。

该文结肠癌组织中Flotillin-1高表达的阳性率为 58.8%，显著高于非结肠癌病例的 14.3%（χ2=7.923，P<0.05），表明Flot1在结肠癌组织中与正常结肠上皮中表达有显著差异，提示了Flotillin-1在结肠癌患者中高表达，可能与结肠癌的发生、发展存在相关性。同时，该文还比较了发生淋巴结转移的结肠癌病例和未发生淋巴结转移的结肠癌病例的癌组织和淋巴结中Flotillin-1的表达，发现在发生淋巴结转移的结肠癌病例中，Flotillin-1在癌组织中的高表达率为92.3%，淋巴结（转移癌巢）中高表达率为76.9%，在非转移的结肠癌组织中高表达率为38.1%，淋巴结中无表达，经Fisher确切概率法统计两组数据均有明显差异。提示Flotillin-1与结肠癌的淋巴道转移有相关性。而在其他恶性肿瘤中，也发现Flotillin-1存在高表达并与转移相关。Li J等[10]发现Flotillin-1在多种上皮性肿瘤中表达升高，其中恶性肿瘤81.48%表达上调，交界性肿瘤也有50%。Guo AY等的研究则提示Flotillin-1在肺腺癌高表达并在肺腺癌的发生、发展中有重要作用，干扰Flot1的表达可以明显抑制肺腺癌细胞向恶性表型发展[11]。Li Y等[12]则发现Flotillin-1在乳腺癌细胞系MCF-7中与AdipoR1相互作用共同介导癌细胞的迁移。上述学者的研究及该文的研究均提示Flot1在各型肿瘤，尤其是恶性肿瘤中表达升高，并与肿瘤的发生、发展、转移和转归密切相关。

综上所述，Flotillin-1在结肠癌中高表达并与结肠癌的淋巴结转移密切相关，可以将其作为反映结肠癌病情严重程度的指标，未来也有潜力作为靶向治疗结肠癌的靶标之一。