舒洛地特原料药安全性检查法研究

张 娟，魏 霞，李水仙，祝清芬

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101）

舒洛地特有抗血栓、降低血黏度、调血脂、减少血小板聚集、保护肾脏等作用，属多组分生化药物，有多种生物活性，用于治疗有血栓形成危险的血管性疾病及糖尿病肾病。为保证其用药安全性，提高药品质量，应做好原料药的安全性检查，但现行的2015年版《中国药典》及局颁标准均未收载舒洛地特。本研究中对舒洛地特的过敏反应、降压物质和异常毒性检查方法学进行探讨，确定限值，为制订其质量标准提供依据。现报道如下。

1 动物、仪器与试药

1.1 动物

ICR小鼠75只，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鲁）20140007；Hartley豚鼠42只，普通级，体质量250～350 g，雌雄各半，购自济南金丰实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鲁）20140006；猫1只，体质量3.5 kg，雄性，购自市场。饲养条件：小鼠饲养于屏障级动物实验室，豚鼠和猫饲养于普通级动物实验室，使用许可证号均为SYXK（鲁）20130012。温度20～25℃，日温差≤3℃；相对湿度40% ～70%；每1 h换气次数不少于10次；照明12 h，明暗交替。经动物伦理委员会同意后开始试验。

1.2 仪器

BL-420E型生物机能实验系统（成都泰盟科技公司，量程为 ±0.5 V ～ ±20 μV）；BSA4202S型电子天平（检测精度为0.06 mg），CP225D型电子天平（检测精度为0.01 mg），均购自德国Sartorius公司。

1.3 试药

舒洛地特（国内某公司。样品A，批号为DYHSLDT20150501，含量为 12 LSU／mg，干燥失重 1.6%；样品B，批号为 DYH-SLDT20150502含量为12 LSU／mg，干燥失重2.7%；样品C，批号为DYH-SLDT20150503，含量为 13 LSU／mg，干燥失重1.0%）；氯化钠注射液（山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司，批号为16030202，规格为每支 10 mL ∶90 mg）；苯巴比妥钠注射液（广东邦民制药有限公司，批号为130535，规格为每支100 mg）；戊巴比妥钠（山东西亚化学工业有限公司，批号为05636）；肝素钠（东营天东制药有限公司，批号为KH2-1704009，纯度为98%）；磷酸组胺（中国食品药品检定研究院，批号为150510-201313，规格为每支20 mg）。

2 方法与结果

2.1 过敏反应检查

限值确定：取豚鼠24只，随机分为6组，每组4只，雌雄各半，取样品 C，将其分别配成 1 200，600，300 LSU／mL浓度的供试品溶液，分别腹腔注射和静脉注射，给药体积均为1mL，连续观察7d。按每只豚鼠体质量 300g 计（下同），剂量分别为 4000，2000，1000LSU／kg，相当于普通成人（60 kg，下同）1 d最大剂量的400倍、200倍和100倍。结果，4 000 LSU／kg剂量组豚鼠腹腔注射药物后出现挠鼻、步态不稳等现象，注射1 d后症状消失，其他各组豚鼠均未出现明显毒性反应，提示豚鼠腹腔注射和静脉注射舒洛地特的无毒性反应剂量均不超过2 000 LSU／kg。根据致敏和激发剂量应小于豚鼠该途径的急性毒性反应剂量，激发剂量应大于致敏剂量的指导原则[1]402，本品过敏反应检查时采用临床拟用浓度300 LSU／mL的供试品溶液进行致敏和激发。即设定致敏剂量为500 LSU／kg，激发剂量为1 000 LSU／kg。

供试品检查：取豚鼠18只，雌雄各半，按体质量随机分为3组，分别对3批样品进行过敏反应检查（以300 LSU／mL供试品溶液作为致敏液和激发液），各组豚鼠分别隔日腹腔注射相应致敏液0.5mL，连续注射3次。第1次腹腔注射后14 d每组取3只豚鼠，分别于小隐静脉注射相应激发液1 mL；第1次腹腔注射后21 d，每组取剩余3只豚鼠，分别于小隐静脉注射相应激发液1 mL。观察给药后30 min内产生的反应。依据2015年版《中国药典（四部）》通则1147“过敏反应检查法”判断结果。结果，豚鼠均未出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏（或咳嗽）3声、紫癜和呼吸困难等现象，也未出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象[1]159[2]428-429，均为阴性。

2.2 降压物质检查[3-4]

猫的灵敏度检查方法：猫麻醉后固定于保温手术台上，分离气管并插管使呼吸通畅，分离一侧颈动脉，插入充满抗凝剂（1000U／mL的肝素钠溶液）的动脉插管，插管另一端通过生理压力传感器与生物机能试验系统相连，记录动物血压。分离一侧股静脉，插入通过软管与可调定量加液器相连的静脉插管，用于注射药物、组胺并补充氯化钠注射液[2]335-336。按2015年版《中国药典（四部）》通则1145“降压物质检查法”，首先检查动物灵敏度，结果符合规定。详见表 1。

表1 猫灵敏度检查结果

限值确定：取样品C，加氯化钠注射液溶解稀释，制成浓度为250 LSU／mL的供试品溶液。按2015年版《中国药典（四部）》通则1145“降压物质检查法”试验，注射剂量（dT）50 LSU／kg，各次注射速率基本相同。分别记录给药前后的血压值，重复3次，计算药物引起血压下降的反应值。结果，50 LSU／kg剂量下动物血压轻微下降（分别下降 0.70，0.05，0.66 kPa，平均 0.47 kPa）。根据2015年版《中国药典（四部）》通则9301“注射剂安全性检查法应用指导原则”[1]401，一般以临床最大单次用药剂量的0.2～5.0倍作为降压反应物质检查剂量限值，急重病症尽量采用高限值。考虑到本品临床最大单次用药剂量为每天1支（2 mL∶600 LSU），肌肉注射或静脉注射，连用15～20 d。临床最大单次用药剂量的5倍，即为 5×（1×600／60）LSU／kg=50 LSU／kg，因此选用50 LSU／kg的剂量作为检查限值。

供试品检查：分别将3批样品用氯化钠注射液稀释成浓度为250 LSU／mL的供试品溶液，dT为50 LSU／kg，磷酸组胺标准品注射剂量（dS）为 0.1 μg／kg，以 dS，dT，dT，dS4个剂量为1组依次注射，记录反应值。然后以第 1（dS1）与第 3（dT2）、第 2（dT1）与第 4（dS2）剂量所致反应值分别比较，如dT所致反应值均不大于ds所致反应值的50%，即认为供试品的降压物质检查符合规定；否则按上述次序继续注射1组4个剂量（分别用dS1′，dT1′，dT2′，dS2′表示），并按相同方法分别比较两组内各对ds、dT剂量所致反应值；如dT所致反应值均不大于ds所致反应值，即认为供试品的降压物质检查符合规定[1]158[2]336-337。结果3批舒洛地特的降压物质检查均符合规定。详见表 2。

表2 舒洛地特降压物质检查结果

2.3 异常毒性检查

半数致死量（LD50）试验[5-7]：取小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半。取样品适量，加氯化钠注射液配制成浓度为2431 LSU／mL的供试品溶液，并按等比级数0.7 稀释成1701.7，1191.2，833.8，583.7，408.6LSU／mL的系列浓度，分别尾静脉注射供试品溶液（样品批号为DYH-SLDT20150503）48 620，34 034，23 844，16 676，11 674，8 172 LSU／kg，注射剂量为 20 mL／kg，注射速率为0.1 mL／s。观察给药后72 h内小鼠死亡情况及出现的反应，结果见表 3。Bliss法计算 72 h内LD50。动物死亡数、LD50和LD50可信限结果见表 4。回归方 程Y（Probit）=-11.105+3.734 4 log（D），LD50=20 534 LSU／kg，LD50（Feiller校正）95% 可信限为15 957 ～ 26 580 LSU／kg。

表3 舒洛地特小鼠急性毒性试验结果（n=10）

表4 Bliss法计算舒洛地特 LD50结果（n=10）

限值确定：根据2015年版《中国药典（四部）》通则9301“注射剂安全性检查法应用指导原则”[1]401，如难以计算出最低致死量，可采用小于LD50可信限下限的1／4（建议采用1／8～1／4）。如LD50与临床体质量剂量之比小于20，可采用LD50可信限下限的1／4或LD1可信限下限的1／3。舒洛地特临床体质量最大剂量为10LSU／kg，其LD50与临床体质量剂量之比为2 053.4倍（大于20）。异常毒性检查限值可采用小于LD50可信限下限的1／8～1／4，即 1994.6～3989.2LSU／kg。异常毒性限值采用LD50可信限下限的 1／8，即 1994.6LSU／kg（≈2000LSU／kg）。为保证用药安全，限值可适当严格，拟确定舒洛地特异常毒性检查时采用80 LSU／mL的供试品溶液，每只小鼠静脉注射给药0.5 mL，小鼠体质量按20 g计算，剂量相当于2 000 LSU／kg。

供试品检查：取3批供试品，分别用氯化钠注射液配制成80 LSU／mL的供试品溶液，根据2015年版《中国药典（四部）》通则1141，每批供试品取小鼠5只，每只小鼠尾静脉注射供试品溶液0.5 mL，4～5 s内匀速注射完毕。给药后48 h内，3组小鼠均未见死亡，表明3批舒洛地特均符合规定[1]153[2]305-306。

3 讨论

舒洛地特作为抗血栓药治疗各种心血管疾病，在国外应用已超过20年[8]。其生产工艺过程中有可能污染组胺、类组胺样降血压物质、异源蛋白、未知过敏反应物质及毒性杂质，且缺乏有效的理化分析方法加以判断，影响药物的疗效及安全性。

过敏反应和急性毒性试验均显示舒洛地特有一定毒性，豚鼠的毒性症状主要表现为挠鼻、步态不稳等现象，小鼠的毒性症状主要表现为呼吸急促、步态不稳、跳跃、抽搐等，异常毒性设定限值时发现，采用LD50可信限下限的1／4进行供试品异常毒性检查时，仍有小鼠死亡，临床用药有可能产生过敏及急性不良反应的风险。但由于其制剂在临床使用的浓度远低于产生毒性的浓度，设定的过敏反应和异常毒性的限值可保证其临床用药安全。目前，欧美等发达国家的医药企业正逐步取消异常毒性检查项，但我国医药企业的生产工艺水平参差不齐，若原料质量及工艺控制出现问题，则均会导致杂质掺入[9-10]，毒性反应不能忽视，异常毒性检查仍有必要设立，以控制毒性杂质含量[11]。建议生产厂家加强对产品的质量控制和改进生产工艺[12]。

通过建立舒洛地特原料药过敏反应、降压物质、异常毒性检查法，可控制由于原料药质量问题在临床使用中引起的毒性反应、过敏反应和降压反应等严重不良反应的发生，药品安全性检查法控制药品质量的同时，还可结合临床使用，但应注意监测凝血指标。舒洛地特服药后可能会出现发热反应，建议进一步对其热原进行检查，为临床用药的安全性提供保障。