嗅球成鞘细胞在脊髓损伤修复中的调控机制*

胡小莉，吴艳青，叶军明，钟兴凤，李 艺，张观音生，康艳敏

(1.赣南医学院 a.2017级硕士研究生；b.麻醉系；c.2016级硕士研究生；d.2018级硕士研究生，江西 赣州 341000；2.温州大学生命科学研究院，浙江 温州 325035)

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是中枢神经损伤最严重的创伤之一，其病理变化包括原发性损伤和继发性损伤两个过程。继发性损伤是一系列复杂的分子事件，包括离子稳态失调、局部水肿及缺血、局灶性出血、兴奋性氨基酸的毒性作用、氧自由基压力和炎症反应等；继发性损伤将进一步导致胶质瘢痕、囊腔空洞和炎症反应等慢性SCI反应[1]。继发性损伤是一种细胞分子水平上的长时程主动调节过程，其所引起的损伤比原发性损伤严重。因此，治疗策略的选择更多是针对于如何有效缓解SCI后的继发性损伤。目前，SCI的治疗策略多样化，但仍不够完善，因此积极探究有效的治疗策略极大的改善SCI的预后迫在眉睫。目前也有许多针对SCI的治疗策略，如神经干细胞移植[2]、药物治疗、组织工程支架的应用[3]、基因治疗[4]，间歇性低氧和高氧预处理的物理防御方法[5]及联合硬膜外刺激和运动训练为导向的综合治疗[6]等。 但是，这些方法仍然存在一些不足，比如神经干细胞在脊髓损伤环境中并不能顺利地分化成神经元，而是分化成星型胶质细胞等；其它方法中亦有不同程度的限制使治疗难以达到最佳的效果。OECs是一类具有类干细胞的多功能特性的细胞，能有效减少神经元的变性，促进神经纤维及轴突的再生，使脱髓鞘的轴突再髓鞘化，建立新的传导通路，形成新的突触，进一步恢复电传导功能方面有突出的作用，同时OECs能有效改善微环境，介导免疫调节，减少炎症及抑制分子的存在。由上可见，OECs对于损伤后功能的改善具有明显的优势，在治疗神经损伤修复中具有较大应用前景。

1 嗅球成鞘细胞的生理学特性

1.1OECs具有终身再生特性OECs是功能上介于星形胶质细胞和施万细胞之间的一种特殊的胶质细胞，兼有星形胶质细胞和施万氏细胞的特性。已有研究证实纯化的OECs能够分化成两种不同形态及不同表面标记的细胞，即星型胶质细胞样OECs和施万细胞样OECs(图1)。星型胶质细胞样OECs为扁平状，表达高水平E-NCAM和GFAP，而P75NTR阴性；而施万细胞样OECs表达P75NTR，部分为GFAP阳性而E-NCAM阴性(图2)。综合以上两种细胞的特性使该细胞成为促进神经损伤修复有利的候选细胞之一，它具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等作用，可为轴突生长提供了适宜的微环境，并具备较强的迁移能力。OECs不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。嗅黏膜中的神经元是唯一出生后才生长并在成年时继续分化的神经元，且在损伤后仍能从基底膜分化为神经元，形成轴突穿出筛状板(图3)。在此过程中，OECs将伴随生长并形成轴突索支架，引导轴突进入嗅球，最终与嗅球中的靶细胞建立突触联系[7]，OECs在神经元轴突能顺利延伸的过程起到非常重要作用。另外，区别于其它胶质细胞和施万细胞，OECs还具有终身神经再生功能。

1.2OECs分泌神经营养因子和细胞粘附因子OECs在嗅粘膜固有层中的嗅上皮和伴随生长的嗅神经及嗅球中的嗅神经层和嗅小球层含量很高，可塑性强，且还能够释放多种神经营养因子和轴突延伸的生长因子[8]，这些生长因子都是神经元生长、发育、分化、成熟的必需因子，包括脑源性神经生长因子(Brain-derived nerve growth factor，BDNF)、胶质细胞源性神经生长因子(Glial cell-derived nerve growth factor，GDNF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、神经营养素3和4(Neurotrophin 3/ Neurotrophin 4，NT-3/NT-4)等。睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CTNF)是一种在中枢和外周神经损伤后能高表达的神经营养因子，参与神经元的存活、分化、生长和成熟过程，可防止轴突损伤反应敏感引起的神经元胞体的变性和死亡，具有保护神经的营养作用。Wewetzer[9]等发现OECs还能分泌CTNF并表达该因子的受体。同时，已有研究报道[10]OECs分泌的BDNF能促进神经轴突的再生，且中枢神经系统中的BDNF是强大的神经元兴奋和突触传递的调节剂[11]。还有学者[12]通过RT-PCR检测发现OECs中可表达碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、血小板源性神经生长因子(Platelet-derived nerve growth factor-B，PDNF-B)mRNA，并表达神经营养因子受体如TrkA、TrkB、TrkC及NGFRp75等[13]。此外，OECs包膜上含有细胞粘附分子和轴突生长分子，如层粘连素(Laminin，LN)、纤粘连素(Fibronectin，FN)、神经细胞黏附分子(Nerve cell adhesion molecule，N-CAM)[14]、细胞粘连分子L1(Cell adhesion molecule L1)、含唾液酸的分子 ( PSA-N-CAM)、神经纤维和中间丝等物质。这些分子均有助于神经元损伤后轴突的延伸、迁移，从而为神经轴突的再生提供了良好的微环境, 促进受损神经功能的恢复。

图1 OECs的形态

图2 GFAP荧光标记OECs

图3 OECs在嗅觉系统中的分布

由上可知，OECs具有中枢和外周胶质细胞的特性，它能促进哺乳动物嗅神经的再生，能分泌神经营养因子和神经细胞粘附分子来促进受损神经元的存活，通过分泌细胞外基质诱导体内外神经元轴突的生长和迁移，这些特点使该细胞成为治疗脊髓损伤方面的一个最佳候选细胞。

2 嗅球成鞘细胞治疗脊髓损伤的优势

目前，OECs 被认为是促进SCI再生修复最有前景的候选细胞之一，其不仅可以取自自身的组织进行培养，减少异体造成的免疫反应，同时OECs可分泌丰富神经营养因子和黏附分子，因此收集其条件培养基植入体内可以减少细胞存活力低，免疫排斥和细胞移植手术的限制。已有很多学者将OECs细胞悬液或条件培养基或将OECs与其它细胞联合移植入不同损伤模型的SCI动物体内，均能一定程度上促进运动和感觉功能恢复[15-21]。因此，运用OECs治疗神经损伤修复已成为神经损伤修复治疗的热点研究问题。

2.1嗅球成鞘细胞的迁移能力强干细胞具有自我复制和多向分化潜能，给予一定的刺激还可定向分化成神经元，故干细胞治疗神经损伤也是比较热门的研究领域。目前，已有研究将神经干细胞、骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞等移植到损伤脊髓处，发现干细胞可促进神经损伤修复。但是相对OECs，这些干细胞缺乏迁移能力，且胚胎干细胞亦存在伦理学问题，均在一定程度上限制了这些细胞的应用。另外，施万细胞(Schwann cell，SCs)是与OECs具有相似性的一种细胞，其广泛运用于神经损伤修复治疗。SCs和OECs在发生学上不同，前者起源于神经嵴，而后者起源于嗅板。SCs 是周围神经系统中起主要作用的细胞，其主要功能是形成周围神经系统有髓神经纤维的髓鞘；并可分泌多种神经营养因子、生物活性物质和胞外基质的能力，还能合成多种细胞黏附分子，对神经的生长、延长、发育和成熟有重要的作用；同时对神经元和胶质细胞的存活、凋亡以及周围神经系统的损伤修复等也有调节作用。相对OECs，SCs具有更强的再髓化及促轴突再生能力。但OECs比SCs具有更强的迁移能力，能够扩大分布范围，并且与宿主有更好的连接能力，从而促进神经再生。但是，OECs能通过分泌NGF促进SCs的迁移[22]，所以如果将这两种细胞共移植入损伤脊髓中则可降低GFAP的表达[21]。此外，OECs也可以和干细胞联合治疗SCI，从而发挥各自的优势而具有协同效应。

2.2嗅成鞘细胞促进胶质瘢痕形成轴索通道相比OECs, SCs在促进轴突再生和再髓鞘化等方面更有优势，然而SCs和少突胶质细胞类似，两者对星形胶质细胞的反应不同,因为有研究证实[23-24]施万细胞不能与富含有星形胶质细胞的环境混合且不能发生抑制反应性星形胶质细胞作用，比起OECs，SCs反而更能产生星形胶质细胞，同时该细胞通过上调硫酸软骨素蛋白聚糖能诱导瘢痕肥大[25]。 因此，SCs被认为不适合移植至脊髓再生中。OECs由于可以与靶细胞上的bFGF和肝素分子相互作用[26]，能与星形胶质细胞共同生存在一起；同时，胶质瘢痕中已经活化的反应性星形胶质细胞能通过分泌TNF-α，从而促进OECs的迁移[27]；而且，OECs能于其它细胞类型如炎症细胞相互作用[28-29]，减少反应性星形胶质细胞的形成和胶质瘢痕增生；OECs还可减少细胞间的距离，并形成粘附细胞的紧密链，其在再生过程中充当神经元的生长基质。Li等[30]在研究脊髓横断模型中得到的结果显示OECs链的形成可促进轴突延伸通过胶质瘢痕，即“桥梁通道假说”，使其进入神经损伤的远端，并在这个过程中吞噬疤痕和损坏的组织，抑制星形胶质细胞的活性，减少星形胶质细胞表达GFAP和蛋白多糖[31]。同时，OECs还能分泌神经保护的因子和刺激蛋白生成，从而保护神经元和其他神经胶质，而且具有整合和支持其它细胞类型的能力，提高了损伤脊髓的功能恢复[32]。综上所述，OECs在SCI治疗中具有更广阔的应用前景。

3 嗅成鞘细胞治疗脊髓损伤的作用机制

目前大量研究表明，移植OECs能有效促进脊髓损伤修复[33-34]，但就OECs是否真能促进脊髓损伤后轴突再生和功能恢复仍存在一定争议，或者至少没有达成普遍的共识[35-36]，并且OECs治疗SCI的作用和机制仍不太确定。在此，我们将进一步阐述当前关于OECs治疗SCI的作用机制研究。

3.1嗅球成鞘细胞分泌神经营养因子促进神经元存活和轴突再生

3.1.1OECs通过分泌NGF，NT-3和BDNF来介导神经元和神经突的生长SCI后会导致运动和感觉功能永久的丧失，促进轴突再生是SCI治疗的关键。OECs能分泌多种神经营养因子作用于损伤区变性的神经元，从而支持神经轴突再生，为其提供营养成分。 如OECs能分泌NGF，NGF通过神经元表面的TrkA受体直接作用于损伤神经元，缓解其变性过程，并能促进神经元再生和迁移，与损伤远端的靶细胞重新建立突触联系，形成新的神经环路结构。NGF也可通过刺激VEGF-Akt-eNOS-NO信号通路，改善损伤区新血管形成，进而促进神经元的存活和生长[37]。OECs虽能分泌神经营养因子但毕竟分泌的量有限，且在移植入损伤病变部位时OECs不能完全与宿主整合，有些细胞甚至不能抵抗恶劣的损伤环境会直接死亡，即使存活下来由于免疫排斥等其他各种因素也不一定能长期存活。因此，为了能高效发挥该细胞的优势，有学者将NT-3进行基因修饰移植入OECs胞内这样可以持续产生大量的NT-3营养因子，促进更多的轴突再生和神经突起增生[38]。BDNF也能由OECs分泌，它在保护神经元也具有重要作用。该生长因子是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶信号分子。因此，已有课题组利用慢病毒转染技术激活OECs中Wnt/β-catenin信号通路，并收集OECs的条件培养基，研究发现具有该条件培养基有促进神经元突触发生和神经突生长的作用，表明含有激活Wnt/β-catenin信号通路的OECs移植到SCI体内具有促进轴突再生的潜在应用价值[39]。

3.1.2OECs通过分泌bFGF和GDNF缓解神经元凋亡，促进轴突延伸SCI后会触发如缺血、缺氧、迟发性轴索丧失、细胞死亡、兴奋性毒性和炎症等一系列次级损伤，其中细胞凋亡在继发性损伤中起着非常重要的作用，会引起脊髓进行性退化，并不利于细胞移植。Pellitteri等[40]团队利用缺氧和血清剥夺来模拟OECs移植入损伤区的生存状况，并通过三种生长因子NGF、bFGF和GDNF的处理来验证OECs的存活和增殖能力。该研究发现bFGF在无血清或低氧条件下对嗅鞘细胞的存活和增殖最有效，表明bFGF具有突出的神经保护作用。而且，bFGF可通过活化PI3K/Akt/GSK-3β, ERK1/2 通路和PI3K/Akt/mTOR通路来抑制内质网应激和过度自噬诱导的神经元凋亡，进而促进神经元的存活，并改善SCI后的运动功能的恢复[41-42]。bFGF也可以上调Bcl-2和Bcl-xl等的表达水平，促进促凋亡基因p53和bax的表达明显减少，从而抑制细胞凋亡，保护损伤的脊髓组织[43]。bFGF在嗅上皮下面的固有层选择区域中大量表达。OECs也能分泌bFGF，但毕竟分泌的量有限。因此，如果能外源性加入一定剂量的bFGF则能进一步促进OECs的分裂增殖。研究发现10 ng·mL-1的bFGF能使OECs增殖约3倍，表明bFGF对嗅鞘细胞的促有丝分裂作用[44]。这在一定条件下会形成正反馈刺激OECs分泌更多生长因子和细胞粘附分子，达到良性循环，促进OECs发挥迁移特性，进而保护神经元、促进突起出芽延伸和轴突再生。体外实验已经证明bFGF对不利环境下的嗅鞘细胞有积极作用，这提示复合生长因子bFGF和OECs治疗SCI，可能有利于保持该OECs在损伤环境下的生存和发挥其促再生特性。同时生长因子和OECs两者联合使用，能在发挥各自独特作用的同时也能协同改善损伤区微环境，促进神经元的生存和抗凋亡作用，增强损伤后脊髓的运动功能修复。移植细胞进入损伤位点的成功还依赖于OECs与宿主的整合能力，该细胞已被证明能通过细胞与细胞的接触介导机制来刺激生长和迁移。在该过程中，生长因子GDNF起了重要作用。有研究专门计算注射了GDNF的OECs细胞表面总膜突起次数达到13次，可见GDNF能促进细胞间的信息交流、迁移和神经网络的形成，给神经元营造一个细胞粘附的紧密链，刺激突起延伸，使轴突能穿过或绕过空洞和疤痕区到达尾端，形成正确的靶向联系，最终达到功能性整合[45-46]。

OECs除了分泌以上营养因子作用外，还能分泌其它的营养因子并表达相应的受体如P75NTR、TrkA、TrkB、 TrkC、FGFR1和GDNF受体(GFRα-1和RET)等。这些受体使OECs能表达多功能优势，尤其是细胞迁移，和细胞与细胞间相互作用，还影响了神经元的生存，和轴突再生和生长。因此，OECs表达神经营养因子可能是中枢神经系统损伤后OECs的神经保护作用的潜在机制。另外，嗅鞘细胞与生长因子的复合应用，特别是bFGF可作为促进和增强OECs在神经系统损伤部位移植中发挥促存活和再生特性的一种策略。OECs与生长因子的结合可能成为SCI后促进神经再生和促进运动功能恢复的重要途径。

3.2嗅球成鞘细胞改善微环境从而促进脊髓损伤的修复

3.2.1OECs减少轴突生长抑制分子分泌SCI后会分泌一些轴突生长抑制分子，形成不利轴突生长的微坏境，如髓鞘相关抑制剂(MAIs)包括神经生长抑制因子(Nogo-A)，少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)和髓鞘相关蛋白糖蛋白(MAG)和粘蛋白(tenascin-R)已被确定为这种不利微环境的主要成分。这些抑制因子可能是影响细胞移植治疗SCI修复的一个关键因素，会促使神经干细胞更倾向于分化成星形胶质细胞而不是神经元[47-48]。因此想要更好的促进SCI的修复，改善微环境抑制这些抑制分子是很有必要的。OECs通过启动相关再生基因的表达，减少抑制因子分泌，改善微环境，进一步促进轴突再生[49]。

3.2.2OECs增强髓鞘碎片的吞噬，促进再髓鞘化中枢神经系统损伤后产生的髓鞘碎片含有抑制轴突再生及髓鞘化的分子，因此从损伤部位清除髓鞘碎片对于轴突再生、再髓鞘化及免疫反应的消除至关重要。OECs具有与小胶质细胞类似的独特功能[50]，可表达小胶质细胞的某些受体和特异性标志物，并且可以诱导它们表达先天免疫细胞的组分，即通过p38MAPK途径识别、内化并最终吞噬因损伤微环境导致的变性神经元残基及髓磷脂碎片。OECs分泌的神经营养因子，如GDNF，可诱导片状伪足的扩张来增强其吞噬潜能和迁移能力[45]；NGF和BDNF主要是通过Merk/Erk信号途径促进OECs发挥吞噬功能[51]。由上可知，OECs能吞噬髓磷脂碎片和退化的神经元，清除微环境中不利的成分，帮助脱髓鞘的神经轴突再髓鞘化，最终与损伤远端的靶细胞建立突触联系，进而恢复感觉和运动功能来发挥其独特的神经保护作用。

3.2.3OECs自身分泌神经营养因子改善微环境OEC的移植可能有利于形成适合轴突再生的微环境，有助于保持邻近组织中神经纤维的功能和活力。大量实验数据表明损伤神经元的存活和轴突的生长有赖于细胞因子如神经营养因子等支持分子的存在，而在损伤环境中存活下来的OECs可分泌很多种神经营养因子和轴突生长刺激物质，改善微环境，促进轴突再生和髓鞘形成，进而促进损伤修复。可见，OECs有可能不是直接作用轴突再生，而是创建了一个良好的微环境来修复损伤的轴突。因此关于OECs促进轴突再生的具体机制还需要大量的基础研究来进一步阐明。

3.3嗅球成鞘细胞调控炎症反应保护神经元

3.3.1OECs参与调节炎症反应神经细胞凋亡或退化可产生大量的炎症介质/细胞因子，从而进一步抑制SCI恢复。OEC表面上受体可以识别细胞碎片的一些释放因子，从而有效地将吞噬的囊泡拉向细胞体[52]。一定剂量的LPS刺激OECs能导致细胞应激反应，细胞因子的释放，活性氧的产生以及磷脂酰丝氨酸受体(PSR)的上调，而磷脂酰丝氨酸受体参与介导凋亡细胞碎片的吞噬[53]。OECs还可抑制星形胶质细胞中激活的核因子kB易位及促炎因子粒细胞集落刺激因子的表达，并能与免疫细胞相互作用来调节内源性炎症反应[8]。同时，OECs具有与小胶质细胞类似的特征。Yang H等研究发现[54]，OECs表达Toll样受体并具有应对某些细菌配体的细胞机制。其中，Toll样受体可调节神经炎症和OEC吞噬活性。另外，OECs表达巨噬细胞的标记物OX-42，其可以在细菌入侵和细胞凋亡后迅速被激活，导致炎症因子的表达增加，包括MCP-1、 CXCL-1、iNOS、TNF-α、IL-1b和IL-6。可见，OECs具有胶质细胞的吞噬活性，表明OECs具有先天免疫的特征，这使得OECs在治疗SCI中发挥强大的作用。

3.3.2OECs在炎症环境下的形态可塑性关于OECs如何支持病变核心中的神经元尚不清楚。目前认为可能存在机制为接触介导机制，因为这些神经元完全被OECs包围，这表明OECs可以直接保护独立于星形胶质细胞瘢痕边界的神经元[25]。Li Y等发现OECs可以根据炎症环境的变化来介导神经保护效应。当OECs在促炎环境LPS中，细胞呈长轴形，促进神经突生长和延伸，有利于细胞自注射部位迁移至损伤中心，发挥促进轴突生长作用；当细胞在抗炎环境TGF-B1或IL-4时，细胞呈扁圆形，有利于细胞粘附和生存，并发挥吞噬髓磷脂残基碎片的作用。该研究结果发现ROCK/F-肌动蛋白途径参与促炎和抗炎条件下OEC的可逆形态学变化，通过YAP依赖的L1-CAM上调，ROCK抑制剂Y27632的使用增强OECs的促神经突向外生长作用[55]。

综上所述，OECs具有小胶质细胞类似的特性，还能根据环境的变化来诱导自身形态的改变；同时，OECs能与免疫细胞相互作用，参与并介导炎症反应来发挥吞噬髓磷脂碎片和抑制细胞凋亡的独特功能，降低SCI后神经元的变性，减少巨噬细胞与小胶质细胞等炎症细胞的侵入，从而促进轴突生长和内源性神经干细胞的募集，发挥保护神经元作用，促进SCI后功能恢复(图4)。

图4 OECs促进SCI后神经再生的机制图

4 总结与展望

总之，OECs在治疗中枢神经系统疾病中具有重要作用，其可通过保护神经元，促进轴突再生、改善微环境和介导免疫机制等方面促进受损神经功能恢复。因此，OECs将成为治疗SCI的最佳候选细胞之一，但就OECs促进损伤修复的机制仍需要进一步核实。目前，OECs促进轴突再生方面的研究较多，但是，针对OECs的促血管生成，增加血管密度作用还知之甚少。因此，未来的研究可以从OECs促进损伤区血管生成着手，深入探究血管增生和神经元及轴突的生长的密切联系。通过深入探究OECs促进损伤修复的具体作用机制，为临床使用OECs治疗SCI提供科学依据。另外，OECs单纯治疗难以达到好的效果。因此，将OECs进行基因改造或联合其它方法如将OECs混入三维立体支架、加生长因子和联合其它细胞等方法将是使用OECs治疗SCI的另一种策略。相信对OECs的深入研究，未来会有望治疗急性甚至是长期慢性SCI。