拉坦前列素对人表皮黑素细胞增殖与黑素合成的影响及机制探讨

蔡羽恬 郭宁宁 郭远 王璐媛 刘莉萍 李遇梅

江苏大学附属医院皮肤科，镇江212001

拉坦前列素（latanoprost）是一种前列腺素F2α（PGF2α）类似物，被用于治疗眼内压升高性疾病，包括高眼压和开角型青光眼[1]。根据拉坦前列素使虹膜及眼周皮肤色素沉着增加的药物不良反应，其对于白癜风等色素脱失性疾病的治疗前景得以探讨[2]。数项初步临床研究发现，外用拉坦前列素对局限型、稳定期白癜风皮损效果显著，且其效能至少与一线用药（如0.1%他克莫司）相当[3-6]。为进一步探讨拉坦前列素对表皮黑素细胞的作用，我们将拉坦前列素作用于体外培养的正常人黑素细胞，研究其对黑素细胞增殖及黑素合成的作用。

材料与方法

1.细胞来源：从青少年包皮中分离人表皮黑素细胞后原代培养、传代，至第3 ～5代时使用。本实验所用包皮全部来源于泌尿外科包皮环切术后的遗弃标本，供者年龄＜25岁，均无白癜风病史或家族史。本研究经江苏大学附属医院伦理委员会批准（批件号：SWYXLL20170901），取材前均获得供者知情同意。

2.主要实验试剂：拉坦前列素粉末（纯度99.7%，美国TargetMol 公司），以二甲基亚砜（美国Sigma公司）配制成10-2mol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱储存，实验前将其配制成各实验浓度。分散酶（美国Sigma 公司），254 培养基和人黑素细胞生长添加物（HMGS）（美国Gibco 公司），CCK8 试剂盒（日本DOJINDO公司），Triton X-100（合肥博美生物科技有限公司），Masson-Fontana 黑素染色液（美国Solarbio公司），逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒（日本Takara 公司），小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）、β肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Millipore公司），MITF、TYR、TYRP1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.黑素细胞原代分离与培养：取包皮环切术后组织，用含青链霉素双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，剪除皮下及部分真皮组织，剪成5 mm×5 mm大小，置于0.3%分散酶中消化8 ～12 h。取出组织块，用PBS 冲洗后分离表真皮。将表皮剪碎，加入0.25%胰酶-乙二胺四乙酸，消化10 min，用胶头滴管轻吹悬液后，4 ℃、1 000 r/min（离心半径15 cm）离心5 min，重悬、计数，以5×105个/ml密度接种于直径6 cm 培养皿中。将细胞置于37 ℃，5%CO2培养箱中，隔天换液，待细胞生长至70%～80%皿底面积时，加入0.025%胰酶-乙二胺四乙酸消化传代。选用3 ～5代黑素细胞进行后续实验。利用黑素的嗜银性，将Masson-Fontana 银染色后可见褐黑色黑素的细胞鉴定为黑素细胞。

4.实验分组与处理：前期预实验已排除药物载基对细胞的影响，并已测拉坦前列素对人表皮黑素细胞的IC50值为8.8×10-5mol/L，且10-8mol/L及更小浓度的拉坦前列素处理黑素细胞后，细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成及相关基因mRNA和蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义。因此，将拉坦前列素加入254培养基配制成10-5、10-6、10-7mol/L分别处理培养的人表皮黑素细胞，对照组仅用不加拉坦前列素的培养基处理。

5.CCK8 法检测黑素细胞增殖：将黑素细胞以1 × 104个/孔接种 96 孔板，每孔 100 μl。按上述方法分组给药处理48 h，每浓度组设3个复孔。每孔加入10 μl CCK8溶液，在培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定450 nm 处吸光度（A值）。细胞增殖水平以A450表示。

6.多巴比色法检测酪氨酸酶活性：将黑素细胞以1 × 104个/孔接种96孔板，每孔100 μl。按上述方法分组给药处理48 h，每浓度组设立3个复孔。PBS清洗 3 遍后，每孔加入 1%TritonX-100 溶液 90 μl。将培养板于-80 ℃冰箱中放置30 min，置于室温融化。配制0.1%左旋多巴溶液，每孔加入100 μl。于培养箱放置2 h，用酶标仪测定490 nm 处A值。酪氨酸酶活性以A490表示。

7.NaOH 溶解法检测黑素含量：将黑素细胞以1×105个/皿的浓度接种入直径6 cm 培养皿，按上述方法分组给药处理48 h 后每皿加1 mol/L NaOH溶液1 ml，置于培养箱中溶解黑素12 h。将皿中的液体转移至96 孔板，各浓度组均设3 个复孔，每孔加 100 μl 裂解液。用酶标仪测定 405 nm 处A值。黑素含量以（药物处理组A405/对照组A405）×100%表示。

8.Western印迹检测黑素细胞定向发育及黑素合成相关蛋白MITF、TYR、TYRP1 的表达：将黑素细胞以1×105个/皿种入直径6 cm培养皿。按上述方法分组给药处理48 h 后，用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂 解 液 冰 浴 0.5 h 提 取细胞总蛋白。4 ℃、12 000×g离心10 min 后取上清液，用BCA 法进行蛋白浓度测定后将所提取蛋白进行热变性处理。行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭，分别加入1∶1 000 稀释的 MITF、TYR、TYRP1 和 β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜后加入1∶2 000 稀释的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜。加入ECL 超敏显影剂显色曝光，用ImageJ软件对条带进行灰度分析，将目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值进行归一化处理，比较各组蛋白的表达量。

9.Masson-Fontana 黑素染色：将黑素细胞以5×104个/孔浓度种入6孔板，按上述方法分组给药处理48 h 后每孔加4%多聚甲醛溶液1 ml，室温固定20 min。用蒸馏水轻吹洗涤后静置3 min，重复3遍。用Masson-Fontana黑素染色液按照试剂说明对黑素细胞进行染色后，镜下观察。

10.荧光定量 PCR 检测 MITF、TYR 和 TYRP1 mRNA 的表达：黑素细胞以 5 × 104个/孔种入 6 孔板，按上述方法分组处理48 h后用TRIzol法提取细胞总RNA，参照TaKaRa 试剂盒说明书逆转录制备cDNA 并进行扩增。引物序列见表1。用MxPro QPCR 软件获得代表荧光强度的Ct 值，Ct 目的基因-Ct内参基因 = ΔCt，ΔCt给药组样本-ΔCt对照样本 = ΔΔCt，用2-ΔΔCt代表mRNA的相对表达量。

11.统计分析：定量资料用单因素方差分析法（ANOVA）和LSD-t检验法分别进行多组间比较及组间两两多重比较，P＜0.05 认为差异有统计学意义，每项实验重复3次。采用SPSS 23.0软件分析数据，GraphPad Prism 6.0绘制统计图。

结 果

1.拉坦前列素对黑素细胞增殖的影响：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素组及对照组间细胞增殖水平差异有统计学意义（P=0.024）。10-6、10-5mol/L拉坦前列素组均显著高于对照组（均P＜0.05），但这两组间差异无统计学意义（t= 0.164，P=0.873）。10-7mol/L 拉坦前列素组与对照组差异无统计学意义（P=0.23）。见表2。

2.拉坦前列素对酪氨酸酶活性的影响：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素组及对照组间酪氨酸酶活性各不相同（P=0.002），10-6、10-5mol/L拉坦前列素组均显著高于对照组（P＜0.05），这两组间差异无统计学意义（t=2.200，P=0.059）。10-7mol/L 拉坦前列素组与对照组差异无统计学意义（P=0.063）。见表2。

表1 荧光定量PCR法所用引物序列（5′-3′）

表2 不同浓度拉坦前列素对人表皮黑素细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成的影响

3.拉坦前列素对黑素含量的影响：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素组及对照组间黑素合成量各不相同（P=0.000 3），10-6、10-5mol/L 拉坦前列素组间差异无统计学意义（t=1.264，P=0.242），但这两组均显著高于对照组（P＜ 0.01）。而10-7mol/L 拉坦前列素组与对照组相比差异无统计学意义（P=0.077）。见表2。

Masson-Fontana 染色显示，各浓度拉坦前列素组黑素细胞树突上的黑素颗粒均较对照组数量更多、颜色更深，且随拉坦前列素浓度的升高，黑素颗粒的显色从淡棕色加深至黑褐色。见图1。

4.拉坦前列素对黑素细胞关键基因mRNA 表达的影响：见图2。各组MITF、TYR、TYRP1 mRNA表达量差异均有统计学意义（F值分别为112.594、99.051、342.301，均P＜ 0.01）。10-7mol/L拉坦前列素组MITF mRNA 的表达显著高于对照组（t=3.905，P＜ 0.01）、低于10-6mol/L 拉坦前列素组（t=5.710，P＜ 0.01），10-6mol/L组显著低于10-5mol/L拉坦前列素组（t=7.652，P＜ 0.01），即MITF的表达呈浓度依赖。

图1 不同浓度拉坦前列素对人表皮黑素细胞合成黑素的影响（Masson-Fontana染色×200） 1A：对照组，不加拉坦前列素的培养基组；1B：10-7 mol/L拉坦前列素组；1C：10-6 mol/L拉坦前列素组；1D：10-5 mol/L拉坦前列素组。随拉坦前列素浓度的升高，黑素细胞树突上的黑素颗粒数量增多，黑素颗粒的显色从淡棕色加深至黑褐色

10-6mol/L 拉坦前列素组TYR mRNA 的表达显著高于对照组、10-7、10-5mol/L拉坦前列素组（t= 16.475、12.111、7.516，均P＜ 0.01），且 10-7、10-5mol/L 拉坦前列素组亦高于对照组（t= 4.391、8.958，均P＜ 0.01）。

10-6mol/L 拉坦前列素组TYRP1 mRNA 的表达显著高于对照组、10-7、10-5mol/L 拉坦前列素组（t= 23.846、24.281、3.013，均P＜0.05），10-5mol/L 拉坦前列素组显著高于对照组（t= 20.833，P＜ 0.01），而10-7mol/L拉坦前列素组与对照组相比差异无统计学意义（t= 0.435，P=0.675）。

5.拉坦前列素对黑素合成关键基因蛋白表达的影响：见图3。4 组间MITF、TYR、TYRP1 蛋白表达量差异均有统计学意义（F值分别为30.785、28.371、133.788，均P＜ 0.01）。

图2 不同浓度拉坦前列素对人表皮黑素细胞小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）mRNA 表达的影响 1：对照组，不加拉坦前列素的培养基组；2：10-7 mol/L 拉坦前列素组；3：10-6 mol/L 拉坦前列素组；4：10-5 mol/L拉坦前列素组。MITF的表达随拉坦前列素浓度升高而增加，TYR、TYRP1的表达在10-6 mol/L拉坦前列素组最高。n=3。a：与对照组相比，P ＜ 0.01

图3 不同浓度拉坦前列素对人表皮黑素细胞小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）蛋白表达的影响 3A：Western印迹检测蛋白表达电泳图；3B ～3D：各组黑素细胞MITF、TYR、TYRP1蛋白表达水平柱形图。1：对照组；2 ～4：分别为10-7、10-6、10-5 mol/L拉坦前列素组。MITF的表达随拉坦前列素浓度升高而增加，TYR、TYRP1的表达在10-6 mol/L拉坦前列素组最高。n=3。与对照组相比，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01

10-6、10-5mol/L拉坦前列素组MITF蛋白表达量均显著高于对照组（t值分别为7.082、8.611，均P＜0.01）和10-7mol/L 拉坦前列素组（t值分别为7.082、4.149、5.679，均P＜ 0.01），但10-6与10-5mol/L 拉坦前列素组间差异无统计学意义（t= 1.530，P=0.165），10-7mol/L 拉坦前列素组高于对照组（t=2.932，P=0.019）。

10-6mol/L 拉坦前列素组TYR 蛋白的表达显著高于对照组和10-7、10-5mol/L 拉坦前列素组（t值分别为7.567、8.125、3.884，均P＜ 0.01），10-5mol/L 拉坦前列素组显著高于对照组（t=3.683，P＜ 0.01），而10-7mol/L拉坦前列素组与对照组相比差异无统计学意义（t=0.557，P=0.592）。

10-6mol/L 拉坦前列素组TYRP1蛋白的表达显著高于对照组、10-7、10-5mol/L拉坦前列素组（t值分别为16.161、6.562、17.135，均P＜ 0.01），10-7拉坦前列素组显著高于对照组（t= 9.599、P＜ 0.01），而10-5mol/L 拉坦前列素组与对照组相比差异无统计学意义（t=0.974，P=0.358）。

讨 论

拉坦前列素作为眼科外用药，导致患者虹膜、睫毛及眶周皮肤颜色加深的现象引起了学者的注意[12-13]。在确定此类色素沉着对眼功能及眼周皮肤无不良影响后，研究者针对拉坦前列素在色素脱失性疾病中的应用进行了一些临床研究[3-6]，发现单用拉坦前列素治疗白癜风，可取得较好的复色效果，将其分别与窄谱UVB（NB-UVB）、微针、Fraxel点阵激光和UVA 光疗联合治疗时，复色效果更为显著。

体外研究显示[14-16]，拉坦前列素可诱导酪氨酸酶转录，增强酪氨酸酶活性，从而促进虹膜黑素细胞及黑素瘤细胞的黑素合成。为探究拉坦前列素对皮肤色素脱失性疾病的治疗前景，我们探讨拉坦前列素体外对人表皮黑素细胞增殖及黑素合成的影响，结果显示，10-6、10-5mol/L 拉坦前列素可以促进人源表皮黑素细胞的增殖，并能显著刺激酪氨酸酶活性增加和黑素合成。表明拉坦前列素或可通过酪氨酸酶相关代谢途径诱导黑素合成。

黑素生成过程受多重因素调控，MITF 可调节神经嵴细胞的定向分化和细胞周期进展，参与黑素细胞分裂和黑素化，控制色素生成限速酶相关基因TYR、TYRP1等的表达，是黑素细胞发育存活、黑素生成功能的主要调节者[17]。MITF、TYR、TYRP1 的表达缺失会引起酪氨酸酶活性降低，减少黑素合成，造成皮肤色素脱失[18]。多种针对色素脱失性疾病的治疗研究[19-21]均以MITF、TYR、TYRP1 为治疗靶点，因此我们对上述3种因子从mRNA及蛋白水平进行检测。结果显示，拉坦前列素能不同程度促进MITF、TYR、TYRP1 mRNA 及蛋白的表达，其中MITF 表达的升高呈浓度依赖性，而TYR 和TYRP1的表达在10-6mol/L 拉坦前列素组最高。同时，酪氨酸酶活性与黑素合成水平也在10-6、10-5mol/L 浓度的药物处理后显著升高，故我们认为适宜浓度的拉坦前列素可能通过促进MITF、TYR、TYRP1 的mRNA 和蛋白表达对人表皮黑素细胞的生物活性产生促进作用。同时我们发现拉坦前列素对MITF、TYR、TYRP1 的促进作用并不平行，提示药物可能通过多种机制影响黑素细胞TYR、TYRP1的表达，而非仅通过MITF-TYR 轴，即影响旁枝通路从而导致上游MITF 与下游TYR、TYRP1 基因表达受药物浓度的影响不一致。此外，已测得拉坦前列素在人表皮黑素细胞中IC50值为8.8×10-5mol/L，拉坦前列素对TYR、TYRP1的表达及黑素细胞活性的作用或受较高浓度的影响。不可排除的是，此结果可能受实验条件质控的影响，想要论证此药是否为白癜风治疗的有效、可靠药物，需进行更充分与深入的研究。

综上所述，本研究初步证实拉坦前列素可促进人正常黑素细胞增殖，并可能通过上调MITF、TYR、TYRP1 mRNA和蛋白水平促进酪氨酸酶活性和黑素合成。

因研究水平及条件所限，本研究存在一定的不足和局限性。本实验的研究对象是正常的人表皮黑素细胞，如欲将拉坦前列素应用于白癜风患者患者的治疗，选择患者皮损处提取的表皮黑素细胞进行给药实验意义更大。此外，应用白癜风动物模型进一步探索会对拉坦前列素长期用药的有效性、耐药性及安全性的验证有更大帮助。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突