卡非佐米对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用及机制研究

杨洋 张梦芹 周小小 刘炬 蔡攀 胥正锋

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜增生、关节及关节周围组织损害为特点的自身免疫性疾病[1]。RA患者关节破坏呈进行性、不可逆性并累及全身多处小关节，重者劳动力丧失，并严重影响生活质量。RA发病机制目前仍未完全阐明，炎症反应在RA发展中起重要作用[2]。RA患者炎症滑膜能高表达Toll样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）并激活 Toll样受体 2（Toll-like receptor 2，TLR2）、Toll样受体 3（Toll-like receptor 3，TLR3）及 TLR4信号通路，TLR2 及 TLR4可与其下游衔接蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）结合，进一步强化炎症反应[3]。研究表明特异性TLR4拮抗剂能够通过抑制TLR4信号通路阻断免疫性关节炎小鼠的炎症反应，减轻RA患者的临床表现和病理学改变，因此可作为治疗RA的潜在药物靶点。研究显示蛋白酶体抑制剂能够抑制RA患者NF-κB诱导细胞因子释放及诱导活化T细胞凋亡[4]。卡非佐米（carfilzomib，CFZ）为二代蛋白酶体抑制剂，相比于一代蛋白酶体抑制剂具有抗多发性骨髓瘤的高效性和低毒性[5]。CFZ能够通过破坏RANKL诱导的NF-κB活化，有效抑制破骨细胞分化和形成[6]。但CFZ能否治疗RA目前尚不清楚。因此本研究采用不同剂量CFZ治疗佐剂诱导关节炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠，观察疗效，并探究其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 适龄SPF级雄性SD大鼠35只（SCXK，#2013-0006，上海杰思捷公司），体重（180±5）g。所有大鼠均饲养于上海分子与细胞生物学研究中心SPF级动物实验室，维持室温22～25℃，相对湿度65%～75%，自由摄食水，模拟正常昼夜规律，每日光照12h。

1.2 试剂和仪器 CFZ购自加拿大Onyx Pharmaceuticals公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司；抗-诱导型氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗体、抗-环氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）抗体购自美国Boster公司；抗兔IgG H&L购自英国Abcam公司；Trizol试剂盒、EDTA缓冲液购自美国Thermo Fisher Scientifc公司；硝酸纤维膜购自上海天能科技有限公司；HRP羊抗鼠IgG及HRP羊抗兔IgG购自上海碧云天生物技术有限公司；Nanodrop 2000分光光度计购自美国Applied Biosystems公司；凝胶成像系统购自美国Eastern Kodak公司。

1.3 实验分组、造模及给药 采用抽签法将35只大鼠分为预治疗组、同时治疗组、低剂量治疗组（1.0mg/kg）、中剂量治疗组（1.5mg/kg）、高剂量治疗组（2.0mg/kg）、模型对照组和空白对照组7组，每组5只。造模方法：在SD大鼠右后足底皮下注射0.1ml完全弗氏佐剂[7]，1周后采用上述方式注射不完全弗氏佐剂强化免疫，2周后造模成功。预治疗组：从实验第1天开始每隔2d腹腔内注射1.5mg/kg CFZ（溶解于 0.5ml DMSO溶液），持续 2周，注射时间为实验开始后的第1、4、7、10和13天；在第14天开始造模，2周后终止。同时治疗组：实验第1天开始造模同时腹腔内注射1.5mg/kg CFZ（溶解于0.5ml DMSO溶液），CFZ注射时间为实验开始后的第1、4、7、10和13天。低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组：在SD大鼠造模成功后第1天即实验开始后第15天每隔2d腹腔内注射不同剂量（1.0、1.5和2.0mg/kg）CFZ（均溶解于0.5ml DMSO溶液），注射时间为实验开始后的第 15、18、21、24和27天。模型对照组：造模成功后每隔2d腹腔内注射0.5ml DMSO溶液，注射时间为实验开始的第15、18、21、24和27天。空白对照组：未接受任何处理的健康SD大鼠。

1.4 大鼠患足观察 每隔2d观察大鼠肢体并记录关节病变程度。采用5分法关节炎指数（arthritis index，AI）评估大鼠RA病情。评分标准如下：0分，肢体关节无明显影响；1分，小趾关节轻度肿胀；2分，小趾关节及足部肿胀；3分，踝关节以下肿胀；4分，包括踝关节在内的全足肿胀。

1.5 标本提取

1.5.1 滑膜细胞分离及培养 实验第28天处死各组大鼠，无菌条件下取踝关节滑膜组织，Ⅷ型胶原酶（1mg/ml）消化至少2h后采用100μm滤网过滤。在IMDM培养液中（含 10%FBS、0.05μg/ml庆大霉素和 2.5μg/ml两性霉素B）中培养3～5d，隔天换液。细胞融合后胰酶消化，1:3传代。

1.5.2 踝关节切片 取大鼠踝关节标本固定于10%甲醛中，予 10%EDTA脱钙 7d，石蜡包埋，5～7μm 沿纵轴切片。

1.6 iNOS和COX-2表达水平检测 采用免疫组化法。大鼠踝关节切片置于65℃恒温箱30min，二甲苯脱蜡，乙醇清洗。加热EDTA缓冲液（1∶10稀释）至沸腾，将切片放入装有EDTA缓冲液的修复缸中，在100℃下煮沸持续30min，冷却至室温。然后，将切片用抗原浸泡在1×PBS缓冲液中数分钟，用PBST缓冲液（1×PBS+0.1%Tween20）洗涤3次，每次5min。内源性过氧化物酶用3%的双氧水阻断5min，然后用一抗（抗-iNOS抗体、抗-COX-2抗体）分别孵育踝关节切片进行免疫组化。再进行二抗（抗兔 IgG H&L）重吸收反应后，用PBST缓冲液冲洗玻片3次，每次5min。用DAB染色液避光染色5min，洗涤后染色终止。使用光学显微镜对图像进行采集和分析。使用Image J 1.8.0分析积分光密度值（IOD）。IOD=观测图片中所有阳性染色点的光密度之和。

1.7 破骨细胞检测 采用TRAP染色。将大鼠踝关节切片脱蜡同1.6。脱蜡后切片置于含0.1%TRAP混合液中37℃温育1h。清洗后甲基绿复染5min，晾干，中性凝胶封闭。含有≥3个细胞核TRAP染色阳性的细胞为破骨细胞并在倒置相差荧光显微镜（×100和×200）下计数破骨细胞。显微镜下拍照后使用Image J 1.8.0分析IOD值。IOD=观测图片中所有TRAP染色阳性点的光密度之和。

1.8TLR2、TLR4及MyD88 mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。应用Trizol试剂盒提取滑膜细胞总RNA并测定浓度，逆转录合成cDNA。以GAPDH作为内参，GAPDH 上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；TLR2上游引物：5′-CTACCAGATGCCTCCCTCTTACC-3′，下游引物：5′-GTGCTTGCTGCTCCTGAGTG-3′；TLR4 上游引物：5′-CACAGACTTGCGGGTTCTACATC-3′，下游引物：5′-AGTTCATAGGGTTCAGGGACAGG-3′；MyD88 上游引物：5′-AAGGAATGTGACTTCCAGACCA-3′；下游引物：5′-GGAATTCAGTCGCTTCTGTTGGA-3′。反应条件为先行 95℃ 30s，然后 95℃ 5s，60℃ 30s，95℃ 15s，55℃ 30s，95℃ 15s循环45次。使用Nanodrop 2000分光光度计检测TLR2、TLR4及MyD88 mRNA表达水平，使用 2-ΔΔCT法分析结果。

1.9 TLR2、TLR4、NF-κB、磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）及MyD88蛋白表达水平检测 采用Western blot法。使用裂解酶和苯甲基磺酰氟充分裂解滑膜细胞，完全裂解后离心，取上清液进行蛋白定量分析。使用10%SDSPAGE分离蛋白并分别转移至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉封闭1h，所得的膜使用一抗（抗TLR2抗体、抗TLR4抗体、抗 NF-κB 抗体、抗 p-NF-κB 抗体、抗 MyD88抗体和抗GAPDH抗体）在4℃条件下孵育过夜。第2天再用二抗（HRP羊抗兔 IgG）在室温下将膜孵育2h，然后在膜上滴加适量ECL显影液，最后使用凝胶成像系统观察并拍照分析。

1.10 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnet-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIA大鼠后足变化 造模后28d拍摄后足变化典型图片显示AIA大鼠足踝部各关节出现明显肿胀，AI指数达到4分，见图1。分析各组大鼠后足AI发现，模型对照组、预治疗组、同时治疗组及低、中、高剂量治疗组大鼠AI在实验结束时均有所下降。与模型对照组比较，预治疗组、同时治疗组及低、中、高剂量治疗组AI均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中高剂量治疗组降低最明显，见图2。

图1 AIA大鼠后足变化典型图片

图2 各组大鼠后足AI变化曲线

2.2 各组大鼠iNOS和COX-2表达水平比较 与空白对照组比较，模型对照组踝关节切片iNOS和COX-2表达水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与模型对照组比较，预治疗组、同时治疗组及不同剂量治疗组iNOS和COX-2表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

2.3 各组破骨细胞数及IOD值比较 与空白对照组比较，模型对照组破骨细胞数及IOD值均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与模型对照组比较，中、高剂量治疗组破骨细胞数及IOD值均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；但低剂量治疗组、预治疗组和同时治疗组与模型对照组破骨细胞数及IOD值比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表1 各组大鼠iNOS和COX-2表达水平比较

表2 各组大鼠破骨细胞数及IOD值比较

2.4 各组大鼠滑膜细胞TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达水平比较 与空白对照组比较，模型对照组TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与模型对照组比较，中剂量治疗组和预治疗组MyD88 mRNA表达水平均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但两组TLR2和TLR4 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；高剂量治疗组TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；同时治疗组TLR2和TLR4 mRNA表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但两组MyD88表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；低剂量治疗组TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达水平与模型对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图3。

图3 各组大鼠滑膜细胞TLR2、RLT4和MyD88 mRNA表达水平比较（与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，△P＜0.01）

2.5 不同剂量CFZ对Toll样受体（TLRs）/MyD88/NF-κB信号通路影响 低、中、高剂量CFZ均可明显抑制TLR2、TLR4和 NF-κB蛋白表达，中、高剂量CFZ可明显抑制p-NF-κB蛋白表达，仅在高剂量治疗组中可观察到MyD88蛋白表达抑制，见图4。

图4 不同剂量CFZ作用后TLRs/MyD88/NF-κB信号通路各蛋白表达的电泳图

3 讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，好发于中年女性，其病理学特点为慢性滑膜炎、滑膜细胞增生浸润，血管翳形成，最终导致四肢对称性关节破坏。RA早期临床常表现为对称性四肢小关节肿痛、晨僵、关节功能下降，终末期常出现不可逆关节损伤、关节畸形、功能障碍，严重影响患者生活质量[1]。目前RA的治疗药物主要有非甾体类抗炎药物、包括改善病情抗风湿药和免疫抑制剂在内的慢作用抗风湿药、糖皮质激素和生物制剂等[8]。这些药物因能够调节免疫反应、抑制局部炎症、缓解关节肿痛、延缓病情发展而广泛应用于RA治疗。虽然这些药物能够在一定程度上改善患者症状，延缓病情进展，但仍无法逆转RA病变。因此有必要寻找一种新的有效的RA潜在治疗药物。

CFZ为第二代不可逆性蛋白酶体抑制剂，通过特异性抑制20S蛋白酶体的糜蛋白催化位点达到抑制细胞生长作用，主要应用于多发性骨髓瘤治疗[9]。也有文献报道CFZ可以对未分化型甲状腺癌[10]、头颈部癌[5]和结肠癌[11]等起到一定治疗作用。文献报道显示第一代蛋白酶体抑制剂对AIA大鼠有抗炎、抗RA作用[12]，但到目前为止，CFZ研究多集中在恶性肿瘤治疗上，尚无关于CFZ对RA治疗效果的研究报道。

AIA大鼠被广泛应用于人类RA研究，其病理生理学特性很好地模拟了人类RA，其中包括炎症反应、滑膜增生、骨破坏及关节退变[13]，常用于RA治疗药物的筛选研究。本研究采用弗氏佐剂诱导建立AIA大鼠，并使用AI对关节炎严重程度进行评估。免疫组化结果显示关节切片中iNOS和COX-2高表达也同样证实AIA大鼠炎症因子大量释放及建模成功。采用不同剂量CFZ对AIA大鼠治疗观察其抗RA疗效，结果发现CFZ抗RA具有剂量依赖性、并表现出下调踝关节iNOS及COX-2表达水平的能力。预治疗组和模型对照组比较结果显示CFZ具有一定程度预防RA的作用；同时治疗组和模型对照组比较结果提示在RA形成过程中使用CFZ可以达到更有效治疗效果。TRAP染色结果同样表明CFZ能够抑制破骨细胞分化和形成，从而达到缓解RA进展效果。基于本研究所建立的AIA大鼠，采用不同剂量、不同治疗时间对AIA大鼠进行治疗，结果显示CFZ具有治疗RA的潜在作用。

TLRs是炎症反应链的起始蛋白并通过募集多种适配蛋白、在细胞内启动促炎症/抗炎症信号级联反应，其亚型TLR4为关键信号传导蛋白之一[14]。TLR2和TLR4主要在细胞膜中表达，研究显示其在RA发病机制中起重要作用[15]。本研究采用qRT-PCR法分析治疗组和模型对照组游离滑膜组织中TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达水平发现随着CFZ剂量增加，TLR2、TLR4和MyD88表达水平明显下调。据此推断CFZ的抗RA机制可能为：TLR2、TLR4被激活后与MyD88的TLR结构域结合并聚集IL-1受体相关蛋白（IRAK），通过磷酸化IRAK4及IRAK1，进一步激活肿瘤坏死因子相关因子6（TRAF6），并依次降低下游信号蛋白转录生长因子β激酶 1（TAK1）、NF-κB 诱导激酶（NIK）及 IκB 激酶（IKK）的表达，解除对NF-κB抑制作用，使NF-κB进入细胞核并形成活化的p-NF-κB参与炎症反应[16]。TLRs激活信号通路可能导致下游转录因子NF-κB及前炎症因子产物 TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和 COX-2 激活、表达与分泌，引发宿主炎症反应[17]。研究证实激活TLR4能够进一步通过MyD88激活下游NF-κB，同时在RA患者和胶原诱导关节炎小鼠中均发现NF-κB被高度激活并参与滑膜炎症性增生、关节软骨破坏调节[18-19]。TLRs信号通路，尤其是TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被证实是RA的重要发病机制[20]。本研究发现CFZ可以抑制滑膜细胞 TLR2、TLR4、MyD88 mRNA 表达，Western blot结果进一步证实CFZ能够抑制游离滑膜细胞中TLR2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB 和 MyD88 蛋白表达。因此，笔者推断CZF可能通过下调TLRs/MyD88/NF-κB信号通路达到抑制关节炎症反应的效果。

综上所述，本研究结果显示CFZ对AIA大鼠有一定的治疗作用及预防作用，其机制可能是通过下调关节iNOS及COX-2的表达，调控滑膜细胞TLRs/MyD88/NF-κB信号通路，降低关节炎症反应及抑制破骨细胞而起到抗RA效果。