胃饥饿素在老年阿尔茨海默病患者炎症因子调控中的途径和作用探讨

黄澈

阿尔茨海默病(AD)是老年群体常见的导致痴呆的神经系统退行性疾病之一。有研究显示，全世界AD患者总数不低于0.38亿，预计到2050年，AD患者总数将达到1.15亿[1]。从病理学来说，AD主要病理改变为神经斑，伴有神经纤维缠绕和神经元细胞丢失。目前，有关AD的发病机制尚不明确，淀粉样β-蛋白(Aβ)毒性假说是几种主流假说中占主导地位的学说(其他还包括胆碱能神经元假说、Tau蛋白假说和自由基损伤假说等)。Aβ毒性假说认为：Aβ具有神经毒性，能改变患者体内炎症因子表达水平，这些炎症因子透过血脑屏障后将导致中枢神经元损伤，引起AD发病[2]。Toll样受体4(TLR4)在人体内被认为是与炎症反应关系密切的信号转导通路之一，在免疫过程中发挥重要的炎症调节作用。胃饥饿素(Ghrelin)是近年来新进发现的内源性脑肠肽之一，可发挥炎症抑制作用[3]。然而，在AD患者体内是否存在二者之间调节失衡，相关研究较少。因此，本研究旨在探讨Ghrelin在老年AD患者炎症因子调控中的途径和作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2013—2018年收治的老年AD患者173例，诊断参照《神经病学》相关标准[4]。入组条件：①年龄≥65岁。②临床痴呆评定量表(CDR)评分≥1.0分。③无重要脏器功能障碍。④未应用免疫抑制剂或者免疫刺激剂。⑤无免疫系统疾病。⑥无感染性疾病。⑦履行充分告知义务后自愿参与本研究[5]。此外，选择同期于我院进行体检的老年健康人142例作为对照组。两组人员性别、年龄、血压、血脂、血糖等基线数据差异均无统计学意义(P＞0.05)。具有可比性(表1)。

表1 两组人员各项基线资料比较()

表1 两组人员各项基线资料比较()

注：1 mmHg＝0.133 kPa

组别 例数 性别年龄/ 收缩压/ 舒张压/ 三酰甘油/ 总胆固醇/ 空腹血糖/男 女 岁 mmHg mmHg (mmol·L-1) (mmol·L-1) (mmol·L-1)观察组 173 77 96 73.10±6.38 146.68±7.49 89.36±6.03 3.37±0.21 4.51±0.59 5.69±0.57对照组 142 68 74 72.49±6.47 144.23±8.11 88.42±5.97 3.29±0.19 4.53±0.61 5.71±0.59 t/χ2值 0.358 0.471 0.322 0.517 0.091 0.144 0.233 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

1.2 检测方法

1.2.1 血液标本采集 于晨起、空腹、静息状态下，抽取外周肘静脉血15 mL，等分为3份分装，每份5 mL。其中1份全血用于TLR4表达水平检测，2份分离血清后用于Ghrelin和炎症因子水平检测。血清分离方法：室温条件下，以3 000 r/min速度离心10 min；之后以一次性吸管抽取上层血清，于-80 ℃深冻冰箱保存待测[6]。

1.2.2 Ghrelin水平测定 以外周血清(5 mL外周血分离所得)作为检测标本，加入抑肽酶处理。之后以酶联免疫吸附法(ELISA)测定其中酰基化和非酰基化Ghrelin总水平，操作过程参照试剂盒说明[7]。

1.2.3 TLR4阳性率测定 以外周血5 mL作为检测标本。首先，以CD14磁珠分选装置分离其中的单个核细胞，调整细胞浓度为5×105/mL。以10%小牛血RPMI 1640培养液常规培养后，加入500 μL破膜剂固定，避光孵育30 min后以Perm/Wash缓冲液重新悬浮。选取悬浮细胞液100 μL，加入10 μL鼠抗人TLR4抗体。避光孵育30 min后，以磷酸盐缓冲液洗涤3次并重新悬浮。之后采用流式细胞术进行测定，TLR4阳性细胞比率由软件自动计算生成[8]。

1.2.4 炎症水平测定 本研究选择肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和C反应蛋白(CRP)作为炎症水评估指标。以外周血清(5 mL外周血分离所得)作为检测标本，使用全自动化学发光分析仪测定上述炎症因子水平，操作过程参照各试剂盒说明[9]。

1.3 研究方法 比较观察组和对照组Ghrelin、TLR4阳性率和TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP水平。以CDR评分[10]作为依据，分为轻度痴呆亚组76例(CDR 1.0分)、中度痴呆亚组53例(CDR 2.0分)和重度痴呆亚组44例(CDR 1.0分)；比较不同亚组间各观察指标差异，并进行相关性分析。

1.4 统计分析 以EpiData 2.3软件建立数据库，以SPSS 21.0作为统计分析工具，计数资料以()表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；相关性分析采用Spearman等级相关分析法，检验水准统一设定为α＝0.05。

2 结果

2.1 两组人员Ghrelin、TLR4阳性率和炎症水平比较(表2) 观察组Ghrelin水平低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；而TLR4阳性率、TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP水平高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 不同AD亚组Ghrelin、TLR4阳性率和炎症水平比较(表3～4) 随着AD病情加重，Ghrelin水平呈逐渐下降趋势，组间差异有统计学意义(P＜0.05)；而TLR4阳性率、TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP水平呈逐渐增高趋势，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。相关性分析显示，Ghrelin与TLR4阳性率、TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP均呈负相关关系(P＜0.05)；TLR4阳性率与TNF-α、IL-6、IL-1β 和CRP均呈正相关系(P＜0.05)。

表2 两组人员Ghrelin、TLR4阳性率和炎症水平比较()

表2 两组人员Ghrelin、TLR4阳性率和炎症水平比较()

组别 例数 Ghrelin/(ng·mL-1) TLR4阳性率/% TNF-α/(pg·mL-1) IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) CRP/(mg·L-1)对照组 142 23.95±5.21 49.37±7.25 4.16±0.94 3.94±0.81 9.34±2.11 18.52±4.37观察组 173 9.54±2.16 81.26±9.36 13.27±4.35 17.51±4.91 24.37±5.10 33.66±6.79 t值 4.289 3.452 3.767 6.317 3.139 3.664 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 不同AD亚组Ghrelin、TLR4阳性率和炎症水平比较()

表3 不同AD亚组Ghrelin、TLR4阳性率和炎症水平比较()

组别 例数 Ghrelin/(ng·mL-1) TLR4阳性率/% TNF-α/(pg·mL-1) IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) CRP/(mg·L-1)轻度痴呆亚组 76 14.37±4.15 72.24±9.27 8.33±2.15 11.35±2.14 16.38±3.90 25.11±4.70中度痴呆亚组 53 9.06±3.11 80.52±10.15 13.83±4.37 18.33±3.69 22.51±4.71 30.54±6.02重度痴呆亚组 44 6.42±1.57 93.64±12.33 19.44±5.20 26.33±5.31 31.44±6.79 39.47±7.19 F值 7.981 8.864 8.153 8.679 9.031 10.257 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表4 各观察指标相关性分析结果

3 讨论

AD是一种神经系统退行性疾病，自然病程呈进行性发展。AD患者多在发展中国家，且数量以每20年增加1倍的速度增长[11]。目前，AD发病机制尚未完全明确，占主导地位的Aβ学说认为，Aβ为不溶解的具有神经毒性的蛋白纤维，可聚集于神经斑的中心区域，加速神经元细胞死亡；而且Aβ可刺激机体释放一些具有强烈神经毒性的炎性蛋白，上调炎症因子水平导致损伤，而且这一炎症损伤无法被血脑屏障所阻挡[12]。

Ghrelin是新进发现的一种内源性脑肠肽，含26～28个氨基酸残基，由胃底细胞分泌。正常情况下，Ghrelin可在酰基化后透过血脑屏障，在炎症免疫应答过程中发挥保护作用，可以减少小胶质细胞炎性增生，延缓神经元细胞死亡[13]。Toll样受体家族(TLRs)是人体内重要的免疫蛋白分子家族，参与非特异性免疫，也是起着连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁的作用。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。其中，TLR4是TLRs最早被发现的成员之一，可激活下游信号分子引起酶学级联反应，导致细胞损伤[14]。然而，目前Ghrelin是否可以通过TLR4通路影响炎症活化过程并不清楚。

本研究中，我们旨在对Ghrelin和TLR4途径的关系及其下游发挥炎症作用的因子进行探讨。结果显示，与健康人相比AD患者Ghrelin水平较低，而TLR4阳性率较高。这说明在AD患者体内，发挥炎症保护作用的Ghrelin水平较低；而TLR4炎症调节通路被激活，导致下游包括TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP在内的炎症因子过度释放。而在进一步亚组分析中我们发现，随着AD病情的加重，Ghrelin水平进一步下降，而TLR4阳性率进一步升高，与之伴随的是更高的炎症水平。这说明AD患者体内炎症和抗炎因素的失衡会随着自然病程的进展而恶化，后续相关性分析结果也提供佐证，这与叶玉兰[15]的研究结果基本一致。

综上所述，我们认为老年AD患者体内存在炎症和抗炎因素失衡，即Ghrelin可能通过TLR4途径调控下游炎症因子的失访，而且这一失衡会随着自然病程的进展而加重。