青蒿素类化合物的微生物转化研究进展

王闻翰，刘吉华

(江苏省中药评价与转化重点实验室，中国药科大学，江苏 南京 211198)

青蒿素是由我国科学工作者在植物黄花蒿中发现的、并具有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物。青蒿素药理活性广泛，同时具有抗疟，抗炎、抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等多种生理活性[1-6]，尤其在抗疟方面具有显著疗效，曾被世界卫生组织称为“世界唯一有效的疟疾治疗药物”[7]。但青蒿素的水溶性差、生物利用度低、生物半衰期短、潜在脑干神经损伤等不足限制其在临床上的应用[8]。因此，对青蒿素类化合物进行结构修饰，寻找新的有效的青蒿素衍生物势在必行，目前青蒿素的主要衍生物有双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯等。为了获取更多高效低毒的青蒿素衍生物，结构修饰已经成为当下的研究热点。结构修饰包括传统化学修饰和微生物转化修饰，本文重点介绍微生物转化修饰，它为青蒿素类化合物的结构修饰及应用发展开辟了新道路。

微生物转化是某种微生物通过一种或几种特殊的胞外或胞内酶将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，类固醇、生物碱、香豆素、黄酮类和萜类都可以由真菌、酵母、细菌、植物细胞和这些来源的酶进行生物转化[9]。其本质是酶促催化反应，与传统化学修饰相比较，具有高效、温和、成本小、手性选择及位置选择强、环保等优点。在不改变原化合物母核的前提下，可以催化许多化学修饰中难以进行的反应。常见的微生物转化类型有：羟化反应、酰基化反应、缩合反应、糖基化反应、水解反应等，它们在青蒿素类化合物的结构修饰中扮演中重要作用，经微生物转化后的青蒿素类化合物不仅增加衍生物种类，提高其水溶性，生物利用度及药理活性，而且扩展新药理活性及为体内代谢组学研究提供新方向。

图1 青蒿素、双氢青蒿素及其衍生物结构图Fig.1 Structural diagram of artemisinin, dihydroartemisinin and their derivatives

1 微生物转化在青蒿素类化合物研究中的应用

近年来，微生物转化技术被广泛应用于天然化合物的合成、结构修饰、先导化合物的发现及药物代谢机制研究等，是获得结构新颖，高效、低毒化合物的重要途径。基于微生物转化在天然药物中的广泛应用，本文就青蒿素类化合物微生物转化研究进行以下几个方面的总结。

1.1 增加衍生物的种类

微生物结构转化技术广泛应用于天然化合物的合成和结构修饰当中，为创造新颖、独特、高效、低毒的药用化合物分子提供了可能。由于青蒿素类化合物过氧桥的不稳定性，传统化学修饰大部分停留在其C-12位的进行衍生化，包括C-O键、C-N键、C-S键衍生物，少部分对C-13、C-14位的甲基进行修饰。对于没有取代基的其他位置C原子，很难进行衍生化，大大制约了青蒿素类衍生物的制备及其活性研究。而微生物由于其特异选择性，能够在青蒿素类化合物的C-1、C-2、C-3、C-8、C-9、C-10、C-11、C-14等位置进行结构修饰，大大丰富了青蒿素衍生物的种类，如表1所示。

1.2 提高水溶性，增加生物利用度

大多数青蒿素类化合物利用微生物在青蒿素结构中引入羟基、氨基、羧酸基等亲水性基团，可增加其水溶性，提高生物利用度。Parshikov[13]通过黑曲霉(Aspergillusniger)将青蒿素成功转化为9β-羟基青蒿素，并根据分子模型和结构活性关系，证明了青蒿素的C-2、C-3、C-9位衍生物具有增加水溶性且最大程度地保证抗疟活性。Zhan[28]研究了雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)对青蒿素的微生物转化，得到4种分离产物分别为6β-羟基青蒿素，7α-羟基青蒿素，7β-羟基青蒿素和6β,7α-二羟基青蒿素，其中化合物6β,7α-二羟基青蒿素为新化合物。由于缺乏官能团，在C-6或C-7位置的青蒿素衍生物的化学合成是不可能的，但生物转化的手段可对其进行结构修饰，并且6β,7α-二羟基青蒿素由于亲水基团羟基的引入，其构效研究表明抗疟活性和水溶性均比青蒿素有所增加。

1.3 提高转化产物药理活性

微生物转化可在化学合成难以实现的位点上进行修饰，部分产物可获得比底物更高的药理活性，为寻找更高效低毒的先导化合物提供途径。Gaur[16]运用匍枝根霉菌(Rhizopusstolonifer)对抗疟药青蒿素进行生物转化, 得到3种青蒿素衍生物：1α-羟基青蒿素，10β-羟基青蒿素和脱氧青蒿素，其中10β-羟基青蒿素化学转化为10β-羟基-12β-蒿甲醚，其在恶性疟原虫(NF54菌株)的抗疟IC50值为18.29 nmol/L，比其前体10β-羟基青蒿素的活性高出10倍。Khalifa[24]运用淡紫灰链霉菌(StreptomyceslavendulaeL-105)微生物转化青蒿素，得到11,12-脱水双氢青蒿素，并测定了11,12-脱水双氢青蒿素在Indochina细胞上的抗疟IC50值为0.35 g/L，较青蒿素下降了一半。Parshikov[29]采用雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)的液体培养物将青蒿素生物转化为7β-羟基青蒿素，产率为78.6%，其分子模型与构效活性研究表明，7β-青蒿素骨架的衍生化使其抗疟活性显著增加。

表1 青蒿素类化合物微生物转化

1.4 扩展新的药理方向

除了传统抗疟活性外，部分青蒿素的衍生物具有良好的抗癌活性。Liu[30]运用灰色链霉菌(StreptomycesgriseusATCC13273)将青蒿素转化为9α-羟基青蒿素，Xu[17]在此基础上成功用该菌株将双氢青蒿素转化为9α-羟基双氢青蒿素，并以肉桂酸修饰9α-羟基双氢青蒿素，得到9α-羟基双氢青蒿素-肉桂酸衍生物，对其进行PC-3，SGC-7901，A549和MDA-MB-435s癌细胞系的体外抗肿瘤活性研究发现，9α-羟基双氢青蒿素-肉桂酸衍生物可有效抑制A549肺癌细胞增殖(IC50=0.20 mmol/L)，并且对正常肝L-02细胞表现出低细胞毒性，其机制为9α-羟基双氢青蒿素-肉桂酸衍生物诱导A549肺癌细胞凋亡，并且使细胞内活性氧簇浓度及亚铁离子浓度升高，最终导致癌细胞的凋亡。Goswami[14]通过单利青霉菌(Penicilliumsimplissimum)将青蒿素修饰为3α-羟基青蒿素和3β-乙酰氧基青蒿素，并且证明了3α-羟基青蒿素和3β-乙酰氧基青蒿素对HCT-15结肠癌细胞具有明显的抑制作用。

1.5 为体内代谢组学的研究提供方向

微生物是体外研究基本生命过程的理想模型，其代谢产物与人体内代谢产物具有高度的相似性。Ma[31]运用秀丽隐杆线虫(CaenorhabditiselegansCICC 40250)开发模拟体内青蒿素代谢的体外微生物模型，通过UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析微生物转化系统中的代谢物和小鼠灌胃给药青蒿素的血浆，鉴定了体外微生物转化的32种代谢物和小鼠血浆的23种代谢物。经比较，两种模型有16种代谢产物是相同的，由此说明秀丽隐杆线虫(CaenorhabditiselegansCICC 40250)模拟体内青蒿素代谢具有相当的相似性。Han[18]分别用蓝色犁头霉菌(Absidiacoerulea)和产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)对双氢青蒿素进行生物转化，得到脱氧二氢青蒿素，8α-羟基脱氧青蒿素，脱氧青蒿素和9α-羟基青蒿素、3α-羟基脱氧二氢青蒿素初级代谢产物，其结构研究表明蓝色犁头霉菌(Absidiacoerulea)和产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)对双氢青蒿素的微生物代谢通过脱氧、异构化和羟基化产生，且研究表明[32]其初级代谢产物后续进行葡萄糖醛酸化过程，与哺乳动物的双氢青蒿素代谢相似[33]，这表明微生物转化与体内代谢途径具有高度相似性，对模拟青蒿素的体内代谢研究具有一定的参考作用。

2 小结与展望

微生物转化是改变青蒿素及其衍生物结构的重要手段，青蒿素微生物转化产物不但增加了水溶性，而且为进一步的结构修饰提供了活性位点，为新药研发开辟新思路，但目前微生物转化技术尚存在较大的局限与诸多不足之处，限制了其工业化生产。微生物转化的作用位点和构型是由底物结构特点和微生物体酶系共同决定的，不同微生物体系转化底物得到的产物数量、种类和得率各有不同，因此，优良菌种的选育是微生物转化的关键条件。在转化的最初设计中, 菌种选育往往是最耗时耗力的工作，而且菌株一旦发生变异，酶系类型也可能发生变化，目标产物可能随之改变。其次，菌种的代谢产物复杂，转化之后的成分鉴定和分离纯化工作程序繁琐, 增加了工业化的成本，这也是影响微生物转化技术工业化生产的障碍之一。另外，菌种的代谢酶属于生物制品，对热及pH敏感，易失活和变性，催化能力有限，这也是影响工业大规模应用的主要障碍之一。因此为了增加生物合成效率，应增加对转化菌株酶系的研究，利用基因工程手段构建工程菌和筛选菌株，优化条件，提高转化酶产量，增强催化活性，阐明底物在特定酶系下的转化过程和转化机制，最终实现微生物转化过程可控，并且可以多领域广泛应用的目标。