Octenisept溶液对根管内粪肠球菌抗菌效果的体外研究

娄亭亭 李慧 刘漪 张旭阳 黄辉

根管治疗术是目前治愈牙髓病和根尖周疾病的主要方法，但其成功率无法达到100%。在根管充填完善但仍有持续根尖损害的根管中粪肠球菌的检出率为24%～77%，粪肠球菌是导致根管治疗失败的主要致病菌之一[1-2]。因此，控制根管内细菌数量，是根管治疗成功与否的关键环节之一。在机械预备根管的同时，辅以具有高效抗菌作用的冲洗液冲洗根管，可降低根管内细菌数量。次氯酸钠是目前临床上使用最广泛的根管冲洗液，常用浓度为0.5%～5.25%。但是对生活组织有较强的毒性作用，且气味难闻[3]，很大程度上限制了高浓度次氯酸钠的使用，也降低了临床疗效。Octenisept是一款高效广谱杀菌药物，杀菌力强且细胞毒性低，常被用于皮肤、黏膜和开放性伤口的消毒，近年来国外将其应用于根管冲洗[4-7]。本实验研究通过检测不同浓度Octenisept对粪肠球菌的抗菌效果，并与不同浓度次氯酸钠对粪肠球菌的抗菌效果对比，探讨Octenisept溶液作为根管冲洗液的可行性及其抗菌性能等相关问题，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

标准粪肠球菌冻干菌株(ATCC 29212)(江西省微生物研究所)；脑心浸出液(brain-heart infusion，BHI)肉汤培养基、电子比浊仪(生物梅里埃公司,法国)；CO2恒温培养箱(Forma公司,美国)；Hfsafe-1200生物安全柜(上海力申有限公司)；Quanta 200F型扫描电子显微镜(FEI公司，美国)；Octenisept®(舒美公司，德国)；8%次氯酸钠溶液、硫代硫酸钠、吐温80、卵磷脂、L-半胱氨酸(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)。

1.2 建立体外粪肠球菌感染根管模型

1.2.1 样本的选择和处理 选取因牙周病等原因新鲜拔除的单根管前牙70 颗，无裂痕、无近髓龋坏、未行根管治疗、根尖孔发育完全。去除牙结石和牙周膜后截去牙冠，标准化根管长度至12 mm。拔髓后，用ProTaper镍钛锉按Crown-down法预备根管至F3。待根管干燥后，用复合树脂封闭根尖孔。将制备好的样本放入含BHI液体培养基的玻璃试管中，121 ℃、1.5 MPa高温高压灭菌后，将装有样本的玻璃试管放入37 ℃需氧条件下孵育24 h，观察细菌生长情况。确认试管内液体清亮，无细菌生长后用于后续实验。

1.2.2 粪肠球菌菌悬液的制备 取少量标准粪肠球菌(ATCC 29212)冻干粉，于2 ml无菌BHI肉汤中培养复苏后划线接种于BHI琼脂培养皿中，置于37 ℃、 CO2恒温培养箱中孵育24 h后，在电子比浊仪上调配菌液浓度为McFarland 0.5(1.5×108CFU/ml)。

1.2.3 体外粪肠球菌根管感染模型的建立 将调配好的粪肠球菌菌液按100 μl/根管接种至根管内。按5 个样本/试管分别放入含5 ml BHI液体培养基的试管中。所有样本置于37 ℃、CO2培养箱中孵育，隔日更换1 次新鲜培养液，培养21 d。期间随机抽样对试管内的培养液进行检测，以确定无杂菌污染。

1.3 检测抗菌效果

1.3.1 实验分组 将70 个成功建立的粪肠球菌根管感染模型，按随机数字表法，以冲洗液的不同分为7 组：A组(5.25%次氯酸钠溶液)、B组(2.5%次氯酸钠溶液)、C组(1%次氯酸钠溶液)、D组(100%Octenisept)、E组(50%Octenisept)、F组(25%Octenisept)和G组(生理盐水阴性对照)，每组10 个样本。

1.3.2 冲洗前根管内取样及细菌培养计数 用无菌纸尖吸干根管内的培养液，注入0.2 ml生理盐水，静置1 min，每个根管插入3 根30#无菌纸尖吸取根管内液体至饱和后，放入装有2 ml生理盐水的离心管中，震荡器上震荡30 s，10 倍系列稀释后取50 μl稀释液接种于BHI琼脂培养皿上，培养48 h后计数菌落数(CFU/ml)。

1.3.3 根管冲洗 各组分别采用新鲜配制的冲洗液5 ml缓慢冲洗根管1 min，使冲洗液充盈根管，静置4 min后，A～C组5%硫代硫酸钠液1 ml冲洗根管并静置1 min，以中和次氯酸钠；D～E组用Octenisept的中和剂(3%吐温80、0.3%卵磷脂、0.1% L-半胱氨酸，无菌PBS液配制)冲洗根管并静置1 min；G组用无菌PBS液1 ml冲洗根管并静置1 min。

1.3.4 冲洗后根管内取样及细菌培养计数 方法同1.3.2。

1.3.5 扫描电镜观察冲洗后根管感染模型 每组冲洗后随机抽取5 个样本置于2.5%戊二醛中固定，48 h后取出；样本沿牙体长轴劈开，PBS缓冲液冲洗3 次，每次5 min；脱水、镀膜后，将实验样本后置于扫描电镜下观察根管内壁冠1/3、中1/3、根尖1/3粪肠球菌生物膜清除情况。

1.4 统计学分析

使用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。将细菌计数结果按1 g(CFU/ml+1)做对数转换，每组冲洗前与冲洗后根管细菌量的比较采用配对t检验；各组冲洗前、后细菌量差值的比较采用单因素方差分析，之后两两比较采用LSD检验。检验水准为α=0.05。

2 结 果

实验各组根管冲洗前、后根管内细菌取样计数值见表 1。

组别n细菌计数(CFU/ml)冲洗前冲洗后差值A107.03±0.112.49±0.124.54±0.04aB107.03±0.093.37±0.093.67±0.03bC107.01±0.073.73±0.043.28±0.03cD107.03±0.093.38±0.093.64±0.03bE106.99±0.073.72±0.053.26±0.03cF107.04±0.123.90±0.033.09±0.04dG107.05±0.104.50±0.072.56±0.03e

注： 不同字母代表组间相比差异有显著性(LSD检验，P<0.05)

经统计学分析发现，冲洗前各组根管内细菌数量差异无显著性(P>0.05)。各实验组冲洗后根管内细菌数量较冲洗前显著降低(P<0.01)。各组冲洗前后细菌计数差值从大到小依次为A组、B组、D组、C组、E组、F组、G组。组间两两比较发现，其中A组与其余各组间差异显著(P<0.05 )；B组、D组间差异无显著性(P>0.05)，与其余各组间有显著差异(P<0.05)；C组与E组间差异无显著性(P>0.05)，与其余各组间有显著差异(P<0.05)。

各实验组经不同冲洗液冲洗后，扫描电镜下分别观察根管内壁冠1/3、中1/3、根1/3段粪肠球菌生物膜的清除效果(图 3)。图中可见A、B、C、D、E、F组冲洗液对根管冠1/3处的粪肠球菌生物膜都有较好的清除效果；各组对根中1/3处的细菌生物膜清除情况一般，A组效果明显优于其他各组，B组与D组清除效果相近，但优于C组与E组(2 组生物膜清除效果相近)，F组效果最差；各组对根尖1/3处的粪肠球菌生物膜效果均较差(图 1)。

图 1 各组冲洗后电镜扫描图像比较

3 讨 论

粪肠球菌为人类肠道正常菌群，是一种机会感染菌。当抗生素大量使用或宿主免疫力低下时，宿主与菌群失衡，粪肠球菌离开正常寄居部位进入其他组织器官，局部聚集粘附于宿主细胞，通过分泌细胞溶解素、明胶酶等毒力因子[8-10]侵袭破坏宿主组织细胞，并耐受宿主的非特异性免疫应答，引起感染性疾病的发生发展。粪肠球菌可侵入侧支根管、根管峡部以及根管侧壁的牙本质小管内，被认为是导致根管治疗失败和持续性根尖周炎的主要致病菌[11]，并有学者提出粪肠球菌所致的难治性根尖周炎引起全身健康的可能[12]。因此，积极控制根管系统内的粪肠球菌数量是必需的。在进行根管治疗时，为尽可能杀灭根管内细菌，在进行根管机械预备的同时，还需要辅以积极有效根根管冲洗。

理想的根管冲洗液应具备以下性能：高效广谱的抗菌作用；良好的组织溶解性能；对生活组织无细胞毒性作用；对牙体硬组织无腐蚀性；且性能持久稳定。Octenisept是一种新型的局部抗菌剂，具有广泛的抗菌谱，对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌有很好的抗菌作用，并对生物膜内细菌有效，且不易产生耐药性[13]。这是由于其主要抗菌成分盐酸奥替尼啶是一种阳离子活性物质，可与带负电荷的细菌细胞壁和细胞膜结合，使其扰乱微生物细胞功能导致细菌死亡。有研究发现Octenisept的抗菌效果不受血液、体液影响，抗菌作用持久稳定[14]。此外，大量研究表明，Octenisept不被皮肤，黏膜或伤口吸收，对生活组织无毒性[15]。因此，本实验选取Octenisept作为根管冲洗液，并检测其对粪肠球菌及其生物膜的抗菌效果。本实验通过建立体外粪肠球菌根管感染模型检测不同浓度的Octensiept作为根管冲洗液对根管内粪肠球菌的清除效果。本实验研究发现100%Octenisept对感染根管模型中的粪肠球菌有较好的杀菌作用，其抗菌效果低于5.25%次氯酸钠，与2.5%NaOCl的效果相当；50%Octenisept的抗粪肠球菌效果与1%NaOCl的相近；25%Octenisept对粪肠球菌的杀菌效果不理想。这一结果与Bukhary等[7]的研究结果一致。但是也有研究发现Octenisept对粪肠球菌的抗菌效果与5.25%NaOCl一致[16]，甚至优于5.25%NaOCl[4]。不同实验结果存在差异，分析原因可能是由于感染模型建立方法和细菌取样方法不同所致。但是，以上结果均表明Octenisept溶液用具有良好的抗菌性能，提示其用于根管冲洗的可行性。

本实验进一步通过扫描电镜观察根管内壁经不同根管冲洗溶液作用后粪肠球菌生物膜的清除效果。结果表明，各种浓度Octenisept溶液与次氯酸钠溶液均对根管冠1/3处的粪肠球菌生物膜有较好的清除效果；对根中1/3处的细菌生物膜清除情况一般，其效果差异与细菌取样结果一致：100%Octenisept与2.5%次氯酸钠结果相近但低于5.25%次氯酸钠，50%Octenisept与1%次氯酸钠结果相近，25%Octenisept最差；各组对根尖1/3处的粪肠球菌生物膜均无明显作用，这可能与进入根管中下段冲洗液的量较少有关。

本实验研究表明Octenisept溶液对根管内粪肠球菌有较好的抗菌作用，尤其是100%Octenisept的作用效果最佳，与2.5%次氯酸钠作用效果相近，可考虑作为根管冲洗剂的替代品。但是，本实验选取的牙齿为单根管的离体牙，根管系统相对简单，所以Octenisept对于复杂根管系统的消毒效果还有待研究。此外，Octenisept用于根管冲洗目前还只限于离体牙的研究，其在患者口腔内的抗菌效果还需要进一步的研究证实。