腹部推拿对慢性疲劳综合征模型大鼠行为学及海马区BDNF、CREB mRNA表达的影响❋

李华南，韩一豪，刘 洋，赵 祥，骆雄飞，王金贵，马 菲

(1. 天津中医药大学第一附属医院推拿科,天津 300193； 2. 天津中医药大学，天津 300193；3. 天津市中医药研究院附属医院科教科，天津 300120)

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是指患者出现不明原因的严重倦怠感，可伴有头痛、失眠、抑郁、食欲不振、体质量下降、免疫功能受损、性功能低下等症状，影响正常工作的临床综合征[1-2]。目前在全世界范围内CFS的患病率是0.4%～2.6%，以20～40岁女性为主[3-4]。近年随着生活节奏加快、工作压力增大等原因，其患病率呈逐年上升趋势。CFS作为社会性疾病，严重影响患者生活质量，给患者家庭和社会带来了沉重负担。

目前，医学界普遍认为CFS的发生与慢性应激、心理、病毒感染、免疫功能失调等因素有关，而神经-内分泌-免疫网络失调可能是CFS发生的重要病机之一[5]。有研究表明，脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)作为与海马神经元可塑性密切相关的物质，在应激状态下，上述蛋白基因表达遭受破坏，进而会影响海马神经元的数量、结构和功能，从而诱发CFS。本项目拟以CFS大鼠为模型，以力竭游泳、旷场实验等行为学评价方法作为效应指标，观察腹部推拿疗效。同时，应用RT-PCR技术观察其对海马区BDNF和CREB mRNA表达的影响，探讨腹部推拿干预CFS的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠30只，体质量200～250 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司(实验动物许可证书号SCXK(京)2014-004)，饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心。

1.2 试剂及仪器

Trizol(invitrogen，美国)；Anti-BDNF、Anti-CREB(Abcam，美国)； M-MLV逆转录酶 (Takara，日本)；RNA酶抑制剂 (Takara，日本)；正常熔点的琼脂糖凝胶 (GIBCO，美国)；SuperRX感光胶片 (FUJIFILM，日本)；DYCP-31BM型水平、垂直电泳装置 (北京市六一仪器厂，中国)；LabWorksTM凝胶成像及分析系统 (UVP，美国)。

2 方法

2.1 动物分组

按随机数字表法将已造模成功的CFS实验大鼠分为腹部推拿组、模型对照组每组各10只。SD雌性大鼠10只为正常对照组。其中，腹部推拿组在造模成功后给予腹部推拿治疗，模型对照组只造模、成功后不予治疗，正常对照组则既不作造模也不给予腹部推拿干预。

2.2 制作CFS大鼠模型

参考相关文献[6]采用悬吊游泳法复制CFS动物模型。每天上午悬吊，下午进行负重游泳，连续12 d。悬吊每3 d循序加量1次，时间分别为1 h、1.5 h、2h、2.5 h。游泳训练前3 d适应性游泳30 min，以后为力竭性训练负重3%。力竭标准：游泳动作明显失调，不能再坚持；沉入水下10 s不能回到水面。除正常对照组外，余余2组均采用上述方法制备 CFS模型。

2.3 腹部推拿方法

选用腹部推拿中核心手法“按法”“摩法”作为主要干预手法。为保证手法的一致性，实验前应用YF-3手法测定仪采集天津腹部推拿名家陈志华操作手法信息，对其手法的用力大小、频率等进行标定，建立手法操作模型。实验过程中手法由专人操作，手法操作者除掌握手法要点外，还需应用YF-3 手法测定仪进行评测，待其手法的力度大小、频率形成的波形轨迹与手法模型基本一致后，方可于实验大鼠身上操作。取穴参考《实验推拿学》[7]选取大鼠的关元穴、中脘穴。

腹部按法：手法操作者以右手食指、中指二指叠按置于关元穴上，余指并拢。以右手腕关节为支点，食、中二指掌指部主动施力，向耻骨联合脊柱方向徐徐按下，力量自轻至重，待指面可感觉到大鼠腹部动脉轻微搏动，按而留之，完成此过程大约30 s，后维持此时的压力及其所达到的深度，静待1 min后手法操作者掌指部徐徐上提，直至完全离开受压部位，此过程大约持续 30 s。如此反复操作2次，共4 min。

腹部摩法：手法操作者肘关节自然屈曲，腕部放松，指掌自然伸直，食指、中指并拢。以食指、中指指面着于施术部位，以腕关节为中心，连同掌、指作环形摩动，并以中脘穴为圆心，做顺时针方向节律性环旋运动，频率宜缓，每分钟20～30次，如此反复操作6 min，每天治疗1 次，连续治疗14 d。模型对照组、正常对照组不给予任何干预手段。

2.4 观察指标和测试方法

2.4.1 大鼠行为学检测 力竭游泳实验:在水深50 cm，水温(25±1)℃的游泳池中行1次力竭游泳，以大鼠从入水游泳至头部沉入水中10 s不能浮出水面的时间为力竭时间。鼠尾悬挂实验:将距大鼠尾端1 cm的部位穿过中央钻有直径1 cm孔的一水平有机玻璃板，板离地面1 m，使动物呈倒挂状，大鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后出现间断性停止挣扎显示“失望”状态，计算5 min内的停止挣扎时间。旷场实验:旷场箱为木质箱，80 cm×80 cm×80 cm，内壁涂黑，底面划为25个面积相等的小方格。测试时，将大鼠置于旷场测试箱底面中心，观察其5 min内的行为。观察指标：以大鼠穿越底面的方格数为水平得分，以后肢站立的次数为垂直得分。记录各组动物水平活动和垂直活动得分。

2.4.2 海马区 BDNF、CREBmRNA表达的RT-PCR检测 将各组大鼠断头，剥离大脑并分离出海马，将剥离的海马组织转移到已清洗干净并高温烘干灭活RNA酶的冻存管中，立即投入液氮中，后移至-80 ℃冰箱。将上述组织样品，分别加入TRIZOL试剂、氯仿、异丙醇后勾浆离心，移去上清液，每1mlTRIZOL试剂勾浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。震荡离心后去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀，提取的RNA保存于-70 ℃冰箱中。后采用一步RT-PCR法，引物基因序列如表1，PCR仪中48 ℃孵育 45 min，94 ℃孵育 2 min后进入 PCR 循环，扩增产物于 4 ℃下保存。紫外透射仪上观察电泳条带并拍照。采用IPP6.0图像处理软件提取并计算条带光密度值，以目的片段与内参照(β-actin)扩增条带的光密度积分值比值评定目的片段 mRNA 的表达水平。

表1 引物基因序列

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠行为学检测结果

表2显示，干预前腹部推拿组、模型对照组2组大鼠力竭游泳时间缩短，与正常对照组之间比较差异显著(P<0.05)。干预2周后，腹部推拿组、模型对照组大鼠力竭游泳时间增加，与正常对照组之间比较差异显著(P<0.05)。腹部推拿组大鼠力竭游泳时间显著增长，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

同时，干预前腹部推拿组、模型对照组2组大鼠悬尾时间延长，与正常对照组之间比较差异显著(P<0.05)。干预2周后，腹部推拿组、模型对照组大鼠悬尾时间缩短，与正常对照组之间比较差异显著(P<0.05)。腹部推拿组大鼠悬尾时间显著缩短，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

另外在旷场实验运动次数方面，干预前腹部推拿组、模型对照组2组大鼠水平及垂直运动次数均减少，与正常对照组之间比较差异显著(P<0.05)。干预2周后，腹部推拿组、模型对照组大鼠水平及垂直运动次数增加，与正常对照组之间比较差异显著(P<0.05)。腹部推拿组大鼠水平及垂直运动次数增加显著，与模型对照组比较差异差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠力竭游泳、鼠尾悬挂时间变化比较

注：与正常对照组比较:*P<0.05；与模型对照组比较：△P<0.05

3.2 各组大鼠海马区 BDNF、CREBmRNA表达比较

图1表4显示，干预2周后与正常对照组比较，腹部推拿组和模型对照组大鼠BDNF mRNA表达水平低于正常对照组(P<0.05)，腹部推拿组经过干预后呈上升趋势，但与模型对照组之间比较无明显差异；与正常对照组比较，模型对照组大鼠CREB mRNA表达水平降低，差异明显(P>0.05)，而腹部推拿组经过干预后，CREB mRNA表达水平高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组BDNF、CREBmRNA及β-actin mRNA 阳性扩增物电泳图

组别鼠数BDNFCREB 腹部推拿组100.331±0.171∗0.644±0.359△模型对照组100.272±0.191∗0.421±0.159∗正常对照组100.594±0.1880.830±0.126

注：与正常组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：△P<0.05

4 讨论

CFS在古代中医文献中并无相应记载，现代多认为属“虚劳”范畴。脾胃功能失调是导致CFS 发生的主要原因之一[8]，病因病机多以脾胃先伤、运化升降失司致湿浊内生，进而阻滞气机、经络，最终使气血不能灌溉四旁所为。正如《丹溪心法》所言：“脾胃受湿，沉困无力，怠惰好卧。”

腹部推拿作为中医特色疗法之一，治疗CFS具有深厚的临床研究基础[9]。中医认为腹部乃人体中枢，脾胃所居，气机升降枢纽，腹部推拿可以调理人体脾胃升降，增强后天脾胃运化，补益气血。同时，经络系统的主要组成部分十二正经和奇经八脉亦循行、分布、络属于腹部。因此，日本汉医汤本求真在其《皇汉医学》中曾言：“腹者，生之本也，故百病以此为根。”《指压疗法》一书中更是强调“腹为万病机”，并认为按摩腹部对于治疗疾病深有影响[10]。这也为腹部推拿防治CFS提供了理论依据。

本实验采用复合应激方法复制CFS模型，模拟人体多重生理、精神应激状态，从而建立CFS大鼠模型。负重游泳包含体力消耗刺激、强迫心理刺激，悬吊则会使大鼠产生愤怒、挣扎、绝望等心理应激，多重应激会使大鼠产生精神和躯体双重疲劳。造模后，应用力竭游泳、鼠尾悬挂、旷场实验等行为学评价方法证明了造模有效及成功。

行为学评价中，力竭游泳时间是反映大鼠体力状况及疲劳的经典指标。本实验结果表明，模型组力竭游泳时间缩短，说明大鼠体力的疲劳、自发活动减少出现了抑郁倾向。腹部推拿干预后，大鼠力竭游泳时间明显升高，说明腹部推拿可以缓解大鼠的疲劳状态。鼠尾悬挂实验是反映大鼠克服外界不良刺激的体力及心理疲劳的程度。研究结果表明，模型组大鼠停止挣扎时间明显高于空白组，反映了大鼠的体力下降以及出现“失望”状态，处于“心理疲劳”和“躯体疲劳”状态。腹部推拿干预后，大鼠停止挣扎时间缩短，较模型对照组改善明显，说明腹部推拿能改善疲劳大鼠的体力及心理状态。另外，旷场实验作为反映大鼠在新环境中的自主探究行为及紧张情绪的经典实验方法，可用来测试动物中枢神经系统的“兴奋”或“抑郁”状态。本实验造模后大鼠的水平及垂直活动得分明显减少，说明造模后大鼠活动度减少，探究行为减弱，对新鲜环境的好奇程度降低，出现“抑郁”的情绪倾向。腹部推拿干预后，大鼠的水平及垂直活动得分明显增加，提示腹部推拿干预后，大鼠对新环境的学习及适应性增强。

BDNF 作为神经网络形成和可塑性的重要调节因子[11]，在中枢神经系统中，其主要在神经元胞体内合成，由轴突末梢释放后通过特异性受体作用于靶组织发挥调节作用。此外，BDNF 也可以反向营养神经元，对海马神经元的生长发育和保护修复起着重要作用[12]。CREB在神经可塑性中的作用体现在通过蛋白激酶A的上调来调节长程抑制作用，从而调节突触的可塑性[13]。研究发现，神经元再生比较集中的海马颗粒细胞下层及其附近有磷酸化CREB的高水平表达，CREB能够增强海马颗粒细胞神经元的整合和功能的可塑性。本实验中，与正常对照组比较，模型对照组大鼠BDNF、CREB mRNA水平降低，腹部推拿干预后BDNF、CREB mRNA表达水平均升高。这些论述充分说明，腹部推拿可以有效缓解疲劳、改善认知，其机制可能与干预BDNF/CREB 信号途径关键分子的表达与功能有关，借此途径促进应激损伤海马神经元的恢复而发挥干预CFS的作用。