柑橘皮发酵汁抗氧化活性和挥发性风味物质分析

付彬，沈婉莹，周梦舟，吴茜，徐宁

(湖北工业大学生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068)

柑橘是世界第一大水果[1]，根据国家统计局最新数据显示，2017年全国柑桔产量约为3817万吨，湖北省柑橘产量居第四位，达466万吨，柑橘在加工过程中约产生20%～50%的皮渣，然而皮渣的利用率却不足10%。传统加工业将这些副产物填埋处理或生产加工成动物饲料[2，3]。皮渣极易霉变发臭，填埋处理会对环境造成严重污染，而加工饲料通常需干燥处理，耗费大量的能源[4]。

柑橘皮中富含精油、色素、纤维素、果胶、木质素、黄酮类化合物等，具有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、治疗肠道疾病、维持血管渗透压、降低血管脆性等作用[5]。

柑橘皮渣开发利用的一个主要途径是围绕其所含成分的提取而展开的，另一个主要途径是利用微生物发酵生产果醋、乳酸饮料、高蛋白饲料和栽培食用菌。运用生物技术对其进行转化，将各种优良的微生物菌种运用到柑橘皮的综合利用中，将是解决柑橘皮渣利用的根本出路[6，7]。本实验采用米曲霉和黑曲霉两种曲霉分别发酵柑橘皮，获得柑橘皮发酵汁，并研究了其抗氧化活性和挥发性风味物质，为探索柑橘皮微生物发酵产品的功能营养提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS3.951(沪酿3.042)、黑曲霉(AspergillusnigerHG-35)：以上菌种均保藏于湖北工业大学湖北省食品发酵工程技术研究中心；温州蜜柑(Citrusunshiu)：湖北土老憨生态农业股份有限公司提供。福林酚、DPPH、TPTZ等试剂：购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

WFJ2000紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器设备有限公司；AB-50电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；YXQ-SG41-280-B高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂；GC-MS 5975-7890A气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

接种 18%盐水

↓ ↓

柑橘皮→蒸煮、灭菌→冷却→添加面粉→混合均匀→制曲→成曲→发酵→成品。

柑橘皮清洁处理后,于115 ℃蒸压20 min,冷却后拌入面粉(橘皮∶面粉为4∶1)并接入米曲霉0.5%，拌匀。制曲32 ℃培养40 h后将曲料装于发酵罐中，并向发酵罐中注入2倍质量的18%盐水，置于35 ℃恒温培养箱发酵。

1.3.2 总黄酮的测定

采用比色法进行测定[8]。吸取适量经稀释后的柑橘皮发酵汁，加入0.3 mL 亚硝酸钠溶液(5%，W/V)反应5 min，之后加入0.3 mL硝酸铝溶液(10%，W/V)，充分混匀后静置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 氢氧化钠，之后定容至10 mL。在510 nm处测定吸光值。选取0，0.1，0.2，0.3， 0.4，0.5，0.6 mg/mL的芦丁作为标准品绘制标准曲线。每毫升柑橘皮发酵汁中总黄酮含量用芦丁当量RE/mL表示，重复3次实验，取平均值。

1.3.3 总多酚的测定

采用福林酚方法[9]。吸取适量经稀释后的柑橘皮发酵汁与5 mL稀释的福林酚溶液(10%，V/V)混合，摇匀后加入2 mL碳酸钠溶液(15%，W/V)，用蒸馏水补充至10 mL，充分摇匀，在黑暗条件下室温显色反应1 h，最后在760 nm处测定吸光值。选取0，10，20，40，60，80 μg/mL的没食子酸作为标准品制作标准曲线。每1 mL柑橘皮发酵汁中总多酚含量以没食子酸当量GAE/mL表示，重复3次实验，取平均值。

1.3.4 抗氧化活性的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考Hsiao等人的试验方法测定DPPH自由基的清除能力。具体方法如下：取0.2 mL稀释适当倍数的发酵汁，加入3.8 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分摇匀，黑暗条件下静置30 min，然后使用紫外可见光分光光度计测定各样品在517 nm处的吸光值，调零为0.2 mL去离子水和3.8 mL乙醇，对照为0.2 mL稀释适当倍数的发酵汁和3.8 mL乙醇，空白为0.2 mL去离子水和3.8 mL DPPH溶液。选取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 μmol/L的水溶性维生素E作为标准品绘制标准曲线。每毫升发酵汁中DPPH自由基清除能力用水溶性维生素E当量μmolTE/mL表示，重复3次实验，取平均值。

1.3.4.2 亚铁离子还原能力的测定

亚铁离子还原能力(FRAP)参考Granato等的方法[10]，具体方法如下：精确吸取100 μL稀释样品，在37 ℃下预热2 min，同样加入已在37 ℃下预热的FRAP工作液(300 mmol/L pH 3.6的乙酸钠缓冲液∶10 mmol/L TPTZ∶20 mmol/L六水合氯化铁为10∶1∶1 (V/V/V) 3 mL，再加入300 μL去离子水，然后混匀反应4 min，用紫外可见分光光度计测定样品在593 nm处的吸光值。空白试剂调零。选取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的七水合硫酸亚铁来绘制标准曲线。每毫升发酵汁中FRAP用亚铁离子当量μmolFE/mL表示，重复3次实验，取平均值。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

挥发性风味物质的测定参照康明丽等的方法[11]。

样品处理：均匀取样品9 mL于25 mL螺旋进样瓶中, 加入3 g 氯化钠, 用聚四氟乙烯隔垫密封；搅拌平衡30 min,平衡温度为40 ℃；平衡后将SPME纤维萃取头经隔垫插入进样瓶，插入深度为1 cm，推出纤维头，顶空吸附30 min；取出萃取头插入GC进样口，推出纤维头，解吸5 min后进行GC-MS分析。

GC条件：HP-5MS色谱分析柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气(1.0 mL/min)；分流比为5∶1；升温程序：起始柱温40 ℃保持 2 min，以5 ℃/min的速率升到120 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min的速率升至220 ℃，保持5 min。

MS条件：电子电离源；电子轰击能量为70 eV；离子扫描范围为33～350 m/z，扫描速度为3.00 scans/s，离子源温度为250 ℃。

2 结果与分析

2.1 总黄酮与总多酚含量

2.1.1 总黄酮含量

黄酮类化合物是一类存在于自然界并具有2-苯基色原酮结构的化合物[12]。柑橘皮渣中含有大量的黄酮类化合物。黄酮具有清除自由基、抗炎症、抗病毒、抗肿瘤等功能[13-15]。黄酮类化合物在医药、食品等行业具有广阔的应用前景。

柑橘果皮中黄酮类化合物的种类与总含量高于果肉[16]。接种不同曲霉得到的柑橘皮发酵汁中总黄酮含量见图1。

图1 柑橘皮发酵汁中总黄酮含量Fig.1 Content of total flavonoids in citrus peel fermented juice

由图1可知，对照组、接种黑曲霉和米曲霉后柑橘皮发酵汁的总黄酮含量分别为57.54，74.43，62.83 μgRE/mL。接种黑曲霉的柑橘发酵汁中总黄酮含量最高，总黄酮含量比对照组增加了29.34%。接种米曲酶后得到的发酵汁中总黄酮含量比对照组增加了9.19%。

2.1.2 总多酚含量

柑橘中植物化学素种类繁多，特别是酚类物质含量丰富，包括酚酸和类黄酮两类植物多酚，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等多种活性功能[17]。接种不同曲霉获得的柑橘皮发酵汁总多酚含量见图2。

与对照组相比，接种黑曲霉和米曲霉发酵明显增加了总多酚含量，含量分别为2.80，5.94 mgGAE/mL，分别提高了49.39%、217.02%。接种米曲霉的发酵汁中总多酚含量约为接种黑曲霉的2倍。

图2 柑橘皮发酵汁中总多酚含量Fig.2 Content of total polyphenols in citrus peel fermented juice

2.2 抗氧化活性

自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合, 转变成氧化物或过氧化物, 使之丧失活性或变性, 细胞功能发生障碍, 引起机体逐渐衰老或病变[18-20]。Sadik等[21]的研究表明黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化活性的功能。接种不同曲霉获得的柑橘发酵汁中抗氧化活性见图3。

图3 柑橘皮发酵汁中抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of citrus peel fermented juice

FRAP法和DPPH法测得的抗氧化活性变化趋势相同。接种曲霉后柑橘发酵汁的抗氧化活性明显增强。接种黑曲霉的发酵汁DPPH·清除能力、FRAP活性分别为4.163 μmolTE/mL、8.044 μmolFE/mL，比对照组分别提高了10.19%、38.34%。接种米曲霉的发酵汁DPPH·清除能力、FRAP活性高于黑曲霉发酵，分别为6.257 μmolTE/mL、12.016 μmolFE/mL，比对照组分别提高了65.65%、106.64%。

2.3 挥发性风味物质分析

对发酵第50天的柑橘皮发酵汁中的挥发性风味物质进行分析(见表1)，从柑橘皮发酵汁中共鉴定出66种挥发性物质，对照组、接种黑曲霉和米曲霉制得的柑橘皮发酵汁分别鉴定出29，49，44种挥发性物质,接种曲霉后可明显增加挥发性物质的种类，其中包括烯烃类、醇类、醛类、酮类、酚类、酯类、芳香烃类以及其他化合物。

表1 柑橘皮发酵汁中挥发性物质成分及相对含量Table 1 Volatile compounds and relative content in citrus peel fermented juice

续 表

注：“—”表示未检测出。

柑橘皮发酵汁中挥发性物质主要以烯烃类化合物和醇类化合物为主。3种发酵汁中均检测出蒎烯、月桂烯、D-柠檬烯、杜松烯、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、芳樟醇、(-)-4-萜品醇、松油醇、2-环己烯-1-醇、香茅醇、乙酸香茅酯、乙酸橙花酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、香芹酮、对乙烯基愈疮木酚、呋喃甲醛、苯甲醛17种挥发性成分。其中包括4种烯烃类物质、6种醇类物质、3种酯类物质、1种酮类物质、1种酚类物质和2种醛类物质。蒎烯、月桂烯、D-柠檬烯、罗勒烯、α-石竹烯、杜松烯、芳樟醇、松油醇、香茅醇、乙酸香叶酯、香芹酮11种柑橘中主要的香气化合物在接种黑曲霉和接种米曲霉的柑橘发酵汁中均被检测出来，其相对含量分别为77.2%、90.23%。说明接种黑曲霉和接种米曲霉的发酵汁中的挥发性成分与柑橘中主要香气成分有部分相同，但是含量有差别。

烯烃类化合物相对含量均达到70%以上，D-柠檬烯含量最高，其中接种米曲霉的发酵汁中D-柠檬烯相对含量高达77.09%。D-柠檬烯对光和热均不稳定, 易被空气中的氧气氧化成有异味的香芹酮[22]。柑橘鲜汁和加工汁储藏60 d后，其中柠檬烯的含量都减少47%[23]。利用橘皮发酵较好地保存了橘皮中的柠檬烯。同时，接种黑曲霉后，柑橘皮在自体酶和黑曲霉产酶条件下发酵催化，将D-柠檬烯转化成癸醛、芳樟醇和α-萜烯醇(香茅醇、金合欢醇、4-萜烯醇等), 从而明显提高了柑橘皮发酵汁的香气品质[24]，使其具有独特的甜香味、松油香味、丁香味、玫瑰香味以及薄荷香味。

接种黑曲霉和接种米曲霉后相比对照组都新增的挥发性风味物质有：罗勒烯、α-萜品烯、α-蒎烯、β-榄香烯、1-石竹烯、(+)-香橙烯、α-石竹烯、4，7-甲基丙烯、α-法尼烯、(-)-g-荜澄茄烯、苯乙醇、紫苏醇、乙酸香叶酯、4-乙基愈创木酚、荜澄茄油萜、异亮氨酸16种，可见接种黑曲霉和米曲霉可明显增加柑橘皮发酵汁中挥发性风味物质的产生。其中，接种黑曲霉的柑橘皮发酵汁中相较对照组和接种米曲霉组增加了2-蒈烯、别罗勒烯、2-呋喃甲醇等15种挥发性物质。接种黑曲霉的柑橘皮发酵汁中风味物质的种类丰富，其醇类化合物、酯类化合物、酮类化合物和酚类化合物种类明显高于其他两组，且相对含量高。

3 总结

本研究利用新鲜柑橘皮、面粉等为主辅原料进行微生物发酵，设置了对照组、接种黑曲霉、接种米曲霉3组实验，得出接种米曲霉后可明显提高柑橘皮发酵汁的抗氧化活性，其DPPH·清除能力提高了65.65%，FRAP活性提高了106.64%，均是接种黑曲霉的柑橘发酵汁的1.5倍。检测出挥发性风味物质数量分别为29，49，44种，以烯烃类物质为主，其次是醇类物质。接种曲霉可明显增加挥发性风味物质的种类，明显提高了柑橘皮发酵汁的香气品质。检测出接种黑曲霉和米曲霉的发酵汁中挥发性风味物质数量略有差异，但种类和相对含量有明显区别。