海水养殖动物源弧菌喹诺酮类药物耐药表型与基因型分析

赵 姝，李 健，2，马立才，刘 旭，2，王 元，房文红

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

弧菌是海水养殖环境中最常见的一类致病菌，广泛分布于海洋环境以及海洋生物体表和肠道中［1］。随着海水养殖规模化和集约化发展，病害频繁发生导致药物使用增多。喹诺酮类（quinolones）药物是一类广谱抗菌药物，能抑制细菌的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV，导致细菌DNA的合成受到抑制。喹诺酮类药物曾是水产养殖主要抗菌药，目前恩诺沙星仍广泛用于水产动物细菌性疾病的防治，214株弧菌对其耐药率为52.3%［2］，抗菌药的使用导致了细菌耐药现象越来越普遍［3］。细菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要为靶酶喹诺酮耐药决定区（QRDRs）的突变和主动外排系统介导的耐药，前者目前以质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）为研究热点，其虽然介导低水平耐药，但是常与整合子或插入序列相连，并协同其他耐药基因［如超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）］一起水平传播，进而对临床细菌性疾病的治疗带来了严重的威胁［4］；后者通常引起细菌的多重耐药性［5］。主动外排系统是细菌普遍存在的一种耐药机制，多见于肠杆菌科的研究报道［6］。多重耐药外排泵的底物广泛，可以外排结构不同的抗菌药物，目前已报道的药物外排泵基因包括 oqxA、oqxB、acrR、marR和 soxR等。外排泵抑制剂可以使细菌对抗菌药物的耐药性降低，洪捷等［7］研究发现，添加外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙后，43株人源肺炎克雷伯菌对环丙沙星和左氧氟沙星的MIC值明显降低。周维［8］对鱼源哈维氏弧菌的研究发现，加入5μg·mL-1的羰基氰氯苯腙后，10株弧菌的MIC值均下降了2～8倍。本研究拟对在前期开展海水养殖源弧菌耐药性监测过程中获得的菌株进行喹诺酮类药物耐药表型和基因型分析，通过比较不同外排泵抑制剂逆转弧菌喹诺酮类药物耐药的效果，以期为弧菌耐药机制研究提供思路，为海水养殖中弧菌病的防治和喹诺酮药物耐药的防控提供一定的理论依据。

1 材料方法

1.1 菌株来源

121株弧菌为本实验室于2014—2015年从上海、山东、海南和江苏等地患病水产动物中分离所得，分别为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）45株，大菱鲆弧菌（V.scophthalmi）42株，哈维氏弧菌（V.harveyi）16株，副 溶 血 弧 菌 （V.parahaemolyticus）14株，鳗弧菌（V.anguillarum）和创伤弧菌（V.vulnificus）各2株。药敏实验质控菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922购自美国典型培养物保藏中心。

1.2 主要试剂

硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和2216E固体培养基购自青岛海博生物技术有限公司。PremixEx TaqTM（Version 2.0 plus dye）、DNA Maker DL2000和琼脂糖购自上海生工生物科技有限公司；Wizard®基因组DNA纯化试剂盒购自普洛麦格（北京）生化科技有限公司。药敏实验所用抗菌药物标准品环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星购自中国药品生物制品检验所。外排泵抑制剂甲基吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP）、利血平（Reserpine，RSP）、羰基氰氯苯腙（Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone，CCCP）和苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺（Phe-Arg-βnaphthylamide，PAβN）购自 Sigma公司。

1.3 实验仪器

恒温培养箱，MIR-254，日本 Sanyo；恒温摇床，SHKE5000-8CE，美 国 Thermo；PCR 仪，Mastercycler pro，德国 Eppendorf；电泳仪，DYY-7C，北京六一仪器厂；凝胶成像仪，G05-7500，美国BIO-RAD；超微量分光光度计，ND5000，北京百泰克生物技术有限公司；微量移液器，德国Eppendorf。

1.4 菌株DNA的提取

在无菌环境下，将保存于-80℃的弧菌分区划线于TCBS琼脂平板，28℃培养16—24 h，然后挑取弧菌单菌落接种于2 mL的TSB肉汤（盐度25）中，28℃摇床中200 r·min-1振荡培养16—18 h，取1 mL菌液置于离心管中12 000 r·min-1离心2 min收集菌体，参照Wizard®基因组DNA纯化试剂盒的操作说明提取PCR模板DNA。利用超微量分光光度计测定基因组DNA浓度，-20℃保存备用。

1.5 药物敏感性实验

本研究采用美国临床和实验室标准协会（CLSI）描述的琼脂稀释法［9］测定试验菌株对喹诺酮类抗菌药物（恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星）的敏感性，同时以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。药敏实验结果判定标准参考CLSI，每个菌株做3个平行。恩诺沙星与诺氟沙星敏感、中介和耐药判定折点分别为≤4μg·mL-1、8μg·mL-1和≥16μg·mL-1，环丙沙星敏感、中介和耐药判定折点分别为≤1μg·mL-1、2μg·mL-1和≥4μg·mL-1。

1.6 外排泵抑制剂作用下各菌株恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星M IC的测定

实验前用MH培养基稀释外排泵抑制剂储存液，使甲基吡咯烷酮、利血平、羰基氰氯苯腙和苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺终浓度分别为100μg·mL-1、40μg·mL-1、5μg·mL-1和 100μg·mL-1。4种外排泵抑制剂浓度为本实验室经过预实验后确定，其他步骤参考1.5药物敏感性实验。

1.7 喹诺酮类药物耐药基因和整合子检测

利用PCR扩增的方法检测试验菌株的外排泵 基 因 （oqxA［5］、oqxB［10］、acrR［11］、marR［11］、soxR［12］）、质 粒 介 导 的 喹 诺 酮 耐 药 基 因（qnrVC［13］、qnrS［14］、qnrA［15］、qnrB［16］）以及 1类整合子 Int1［17］、4类超级整合子 SXT［18］和 I型插入序列共同区ISCR1［19］。PCR引物和扩增时退火温度参考上述文献；扩增产物送往上海生工生物技术有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库进行Blast比对分析。

2 结果与分析

2.1 药敏实验

121株弧菌对恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星敏感性测定结果见表1。121株弧菌中，对恩诺沙星敏感菌株90株，耐药菌株有31株；对诺氟沙星敏感菌株90株，中介菌株10株，耐药菌株21株；对环丙沙星敏感菌株82株，中介菌株17株，耐药菌株22株。对恩诺沙星和诺氟沙星双重耐药的菌株有10株，诺氟沙星和环丙沙星双重耐药菌株14株，环丙沙星和恩诺沙星双重耐药菌株11株，3种药物同时耐药的菌株10株。

2.2 喹诺酮类药物相关耐药基因检测

对121株弧菌质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrVC、qnrS、qnrA、qnrB和外排泵基因 oqxA、oqxB、acrR、marR、soxR进行检测，喹诺酮耐药基因仅检测到qnrA和qnrVC基因，外排泵耐药基因仅检测到oqxB（表 2）。其中，qnrA检出 2株，检出率1.65%；qnrVC检出30株，检出率24.8%；oqxB仅在1株溶藻弧菌（352菌株）中检出，检出率0.83%。对30株qnrVC基因阳性的弧菌菌株进行深一步分析发现，其分为6个亚型，分别为qnrVC1（6株）、qnrVC3（14株）、qnrVC4（2株）、qnrVC5（4株）、qnrVC6（3株）和 qnrVC7（1株）。

2.3 整合子检测

121株弧菌中，检测到含1类整合子Int1菌株39株，含4类超级整合子SXT菌株42株，含I型插入序列共同区ISCR1菌株44株。其中，同时含有3种整合子相关的弧菌17株，Int1和SXT阳性的弧菌23株，Int1和ISCR1阳性的弧菌30株，SXT和ISCR1阳性的弧菌20株。

表1 121株弧菌对3种喹诺酮类药物的M IC值分布Tab.1 M IC distribution of 121 Vibrio isolates to Enrofloxacin，Norfloxacin and Ciprofloxacin

表2 121株弧菌耐药基因检测结果Tab.2 Results of resistant genes of 121 Vibrio isolates

表3 121株弧菌整合子检测结果Tab.3 Integrons detected in 121 Vibrio isolates

2.4 外排泵抑制剂对弧菌的恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星M IC的影响

2.4.1 弧菌恩诺沙星MIC的变化

在 NMP、RSP、CCCP和 PAβN作用下，121株弧菌中分别有72株、64株、114株和39株弧菌对恩诺沙星的MIC降低了2倍及2倍以上（表4）。4种抑制剂多以降低2倍MIC为主，CCCP抑制剂的作用最为显著。PAβN对弧菌恩诺沙星的作用最小，只有32.2%菌株MIC降低了，且最大降低倍数为4倍。

2.4.2 弧菌诺氟沙星MIC的变化

在 NMP、RSP、CCCP和 PAβN作用下，121株弧菌中分别有52株、43株、106株和33株弧菌对诺氟沙星的MIC降低了2倍及2倍以上（表5）。4种抑制剂多以降低2倍MIC为主，CCCP抑制剂的作用最为显著。PAβN使27.3%的菌株MIC值有所下降，且大多数菌株降低倍数为4倍。NMP使1株弧菌的MIC值降低了32倍。

2.4.3 弧菌环丙沙星MIC的变化

在 NMP、RSP、CCCP和 PAβN作用下，121株弧菌中分别有60株、40株、80株和47株弧菌对环丙沙星的MIC降低了2倍及2倍以上（表6）。NMP分别使14株、3株弧菌的MIC值降低了4倍和8倍。PAβN分别使10株和1株弧菌的MIC值降低了4倍和8倍。RSP使14株和4株菌的MIC值降低了4倍和8倍。CCCP是4种药物中使MIC值降低最多的抑制剂，分别使18株、15株、5株、2株弧菌的MIC值下降了4倍、8倍、16倍和32倍。

表4 外排泵抑制剂对121株弧菌的恩诺沙星M IC的影响Tab.4 Effects of four efflus pump inhibitors on Enrofloxacin's M IC s for 121 Vibrio isolates

表5 外排泵抑制剂对121株弧菌的诺氟沙星M IC的影响Tab.5 Effects of four efflus pump inhibitors on Norfloxacin's M IC s for 121 Vibrio isolates

2.4.4 外排泵抑制剂对弧菌的恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星耐药性的影响

4种外排泵抑制剂的效果都很显著，降低了弧菌对恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星的耐药性（表7）。CCCP分别使14株的恩诺沙星耐药菌株、4株诺氟沙星耐药菌株、7株环丙沙星耐药菌株变成敏感菌株；使17株恩诺沙星耐药菌株、2株诺氟沙星耐药菌株、6株环丙沙星耐药菌株变成中介菌株。RSP使4株恩诺沙星耐药菌株、1株诺氟沙星耐药菌株变成敏感菌株。NMP使15株恩诺沙星耐药菌株、1株诺氟沙星耐药菌株、2株环丙沙星耐药菌株变成敏感菌株。PAβN使3株恩诺沙星耐药菌株、1株环丙沙星耐药菌株变成敏感菌株。

2.5 弧菌对喹诺酮类药物耐药表型和基因型比较分析

对121株弧菌的喹诺酮类药物耐药表型和基因型进行比较分析（表8），qnrA仅在2株弧菌中检出，其中1株对环丙沙星表现为耐药，对恩诺沙星和诺氟沙星均表现为敏感或中介；在3种喹诺酮类药物中，qnrVC在耐药菌株中的检出率明显高于敏感或中介菌株，尤其在诺氟沙星和环丙沙星的耐药菌株中检出率明显高于敏感和中介菌种的检出率。其中，1类整合子 Int1（51.6%）和I型插入序列共同区ISCR1（41.9%）在恩诺沙星耐药菌株中的检出率均高于敏感和中介菌株的检出率。外排泵耐药基因oqxB仅检出1株，该菌对3种药物均表现为高耐药，且不与qnrVC和qnrA共存。

3 讨论

3.1 弧菌喹诺酮类药物耐药基因携带情况

介导喹诺酮类药物耐药的机制可分为垂直传播的染色体突变耐药及水平传播的质粒介导耐药两种［20］。qnr基因是已知的一类重要的质粒介导的喹诺酮耐药基因，qnrA是在1998年第一个被发现的此类基因，而后，qnrS和qnrB基因陆续被发现。qnrA、qnrB基因通常与一类整合子相连。在霍乱弧菌中发现的qnrVC基因位于可移动原件上［21］，且在弧菌中分布较多，部分变体以基因盒形式存在于染色体上，另一部分变体则通过转座子或接合性元件等与其他类耐药基因共同传播［22］。本实验中，共检测到2株弧菌携带qnrA基因，且与一类整合子Int1共存，提示qnrA可能与整合子协同作用介导弧菌的耐药性。本实验共检测到30株弧菌携带qnrVC基因，其中，对恩诺沙星耐药菌株10株，对诺氟沙星耐药菌株14株，对环丙沙星耐药菌株16株，可见，qnrVC阳性菌株并不都表现高水平的喹诺酮类药物耐药性。刘旭［3］发现，虽然qnrVC基因不能介导高水平的耐药，但其转移性强，并可在不同种细菌间传播。KIM等［23］发现，霍乱弧菌中分离的由SXT携带的qnrVC3基因可与多种耐药基因结合，导致弧菌的多重耐药性，并验证了qnrVC基因可相对提高菌株对喹诺酮类药物的耐药水平，同时具有可传播性。qnrVC已报道有 7个亚型［13，24-26］，本研究中检出的30株qnrVC阳性菌株存在6个亚型。qnr基因在弧菌中的广泛分布和较大的基因间变异，以及弧菌对喹诺酮类药物耐药表型与基因型存在较大的不一致性，因此推测有更多的qnr基因尚未发现。

表6 4种外排泵抑制剂对121株弧菌的环丙沙星M IC的影响Tab.6 Effects of four efflus pump inhibitors on Ciprofloxacin's M IC s for 121 Vibrio isolates

表7 外排泵抑制剂对3种药物耐药菌株和中介菌株数量的改变Tab.7 Susceptibility results and changes in resistance and intermediate isolates

表8 弧菌对喹诺酮药物耐药表型和基因型比较分析Tab.8 Comparative analysis of Vibrio quinolone resistance phenotypes and genotypes

3.2 弧菌整合子携带情况

整合子是一类能够捕获、吸收和表达外源基因的遗传元件，在细菌的耐药性转移扩散中起到重要的作用，尤其会加重革兰氏阴性菌的耐药现象［27］。其中，SXT元件宿主范围广泛，结合转移频率高，并且以弧菌中发现最多；SXT元件可长达100 kb以上，常携带耐药基因簇floR、strB、sul、dfrA、blaCMY-2等［28］。SXT元件介导的霍乱弧菌或灿烂弧菌基因向大肠杆菌的转移频率均可高达10-5～10-6/受体菌［29］。JIANG等［30］从我国养殖源海参中分离得到的87株副溶血弧菌，其中Int1的检出率达到了100%。本研究通过对121株弧菌中整合子相关元件的研究发现，Int1、SXT和ISCR1的检出率分别达到了32.23%（39/121）、34.71%（42/121）和 36.36%（44/121），提示整合子相关元件的存在可能是弧菌耐药性传播的重要分子机制之一。

3.3 弧菌外排泵与喹诺酮类药物耐药性

细菌抗菌药物耐药相关外排系统的作用机制主要包括：阻断外排泵的能量来源、阻碍底物通过外排泵通道、干扰外排泵组装等。CCCP是抑制质子转运的强解偶联剂，可自由扩散于磷脂膜两侧，破坏质子跨膜梯度，阻断外排转运系统的能量供应［31］。利血平是ATP水解能驱动型的外排泵抑制剂，其本身就可作为某些外排泵的底物，可与抗菌药物竞争结合外排泵蛋白，进而对外排抗菌药物产生抑制作用［32］。PAβN和NMP均属于RND特异性外排泵抑制剂，是一类阻碍药物通过外排泵通道的外排泵抑制剂，其作用机制为结合外排泵相应位点以阻止其他物质与之结合［33］，从而抑制外排泵底物发生外排。4种外排泵抑制剂均能有效逆转部分弧菌喹诺酮类药物的耐药表型，其中CCCP、RSP和NMP能显著地降低弧菌对恩诺沙星的耐药性。

外排泵的外排作用同样是细菌喹诺酮类药物耐药性的重要形成机制，oqxB是第一个质粒介导的RND家族多重耐药外排泵，可水平传播。本研究对121株弧菌的喹诺酮相关外排泵基因携带情况检测发现，这些弧菌中只有一株菌携带外排泵基因oqxB，携带该基因的菌株具有很高的耐药表型，对恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星的MIC值分别为 16μg·mL-1、32μg·mL-1和 64 μg·mL-1，加入4种外排泵抑制剂以后，3种抗菌药的MIC值均显著降低，且以降低4倍及以上为主。陈孝杰［5］实验研究显示，食品动物源和食品源大肠杆菌中oqxAB基因的检出率均达到22.9%，医院临床分离株和宠物源大肠杆菌的检出率也达12.3%和12.0%；且oqxAB基因在水产养殖源弧菌中未曾报道，推测此外排泵抑制剂对弧菌的作用原理与大肠杆菌有所不同，水产上弧菌耐药的机制可能由于其携带的可移动耐药元件对其他种类细菌（如大肠杆菌）上携带的耐药基因的传播而导致的高水平耐药。在本研究中，外排泵基因oqxB不与qnrVC和qnrA共存，提示外排泵基因可能是单独介导弧菌高耐药现象的重要机制。此外，本实验中的外排泵阳性菌株中并未检出其他种类的外排泵基因，外排泵基因并不能完全解释弧菌喹诺酮类药物的耐药表型，是否还存在其他相关的喹诺酮类耐药基因及外排泵基因，还需要进一步的研究和探索。

综上所述，分离自我国海水动物的弧菌部分携带oqxB、qnrVC基因和qnrA基因，多数弧菌同时携带整合子相关元件，如Int1、SXT和ISCR1。外排泵抑制剂实验的结果表明，外排泵抑制剂能够有效地抑制弧菌对喹诺酮类药物的外排作用，从而提高弧菌对喹诺酮类药物的敏感性。本研究结果为海水养殖源弧菌喹诺酮类耐药性研究提供了一种新的思路方向。