钙浓度对聚谷氨酸合成通路中α-酮戊二酸脱氢酶的表达调控

张宸，韩真

（陕西地建房地产开发集团有限责任公司，陕西西安 710075）

聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体缩合而成的环境友好型高分子材料，具有良好的水溶性、生物降解性及生物兼容性，在食品、医药和工农业等领域具有广泛的应用前景。本研究前期从纳豆中分离到一株高产γ-PGA的纳豆芽孢杆菌HSF 1410，在发酵过程中添加 0.1‰（w/v）的 CaCl2能有效降低发酵液黏度，提高γ-PGA产量，且不会引起γ-PGA分子量变化[1]。实验中测得菌体内α-酮戊二酸脱氢酶的酶活明显提高，使得α-酮戊二酸更多的发生氨基化反应形成谷氨酸，进而合成更多的γ-PGA。

γ-PGA合成途径涉及多种酶类，金属离子对发酵过程有重要作用。于B.licheniformisNCIMB 11709、B.subtilisNX-2发酵液中添加不同浓度Mn2+，可获得不同的γ-PGA D-异构体[2]。于Bacillus sp.RKY3 发酵液中添加少量 Mg2+或 K+，能激发细胞生长及增加γ-PGA产量[3]。通常情况下，由于聚合物不断积累，γ-PGA发酵液会随着时间的增加变得非常黏稠，这个现象会严重限制溶氧传质，导致细胞生长缓慢，同时造成γ-PGA产量下降[4]。据报道，向发酵液中加入NaCl可以有效减少泡沫、降低黏度，然而NaCl的加入会明显降低γ-PGA的分子量大小[5]。

本研究从胞内调控角度，研究钙离子是否调控了编码α-酮戊二酸脱氢酶基因的转录水平，进而使酶活性增加，聚谷氨酸产量提高。期望这一研究结果能够为进一步提高γ-PGA合成水平提供人为控制的技术策略。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）菌株纳豆芽孢杆菌 Bacillus subtilisnatto HSF 1410。（2）试剂Trizol，购自上海生工生物有限公司；反转录试剂盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、荧光定量试剂 SYBR® Premix Ex Taq™，购自Takara公司；其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。

（3）实时定量 PCR 仪（PikoReal real-time PCR system美国Thermo公司）；微量核酸蛋白测定仪（Nanodrop ND 2000型美国Thermo公司）；高速离心机（1-14型Sigma公司）；电泳仪（DYY-6C型北京市六一仪器厂）；培清JS-680B全自动凝胶成像分析仪（JS-680B型上海培清科技有限公司）；隔水式恒温培养箱（GSP-9080MBE型山海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

（4）引物实验选用gapdh作为内参基因。采用Primer5.0软件对引物进行设计和分析，内参基因gapdh引物序列 P1：TTCCGCACAAAGACTACCG；P2：AACACGCATTGCTCCACC。ogdh引物序列P3：AAAAGGGTATCAAGTAGGCGGT；P4：AGCATTGGCTGAGTGGTTGA。引物均在南京金斯瑞生物有限公司合成。

（5）培养基。种子培养基：LB培养基。发酵培养基：葡萄糖 20g/L、谷氨酸钠 10g/L、NH4Cl 1g/L、酵母粉 1g/L、K2HPO43g/L、MgSO40.2g/L，pH7.0，121℃灭菌 20 min。

（6）100g/LCaCl2储备液：称取 10g CaCl2，去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min，4℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵菌泥制备

从HSF 1410保藏斜面上刮取一环菌体接至种子培养基（100mL/500mL），摇床上37℃、150r/min，12～16h得到种子培养液。在5份发酵培养基中分别加入CaCl2储备液0、50、100、150μL和200μL，使CaCl2终浓度为0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰和0.2‰。按2%接种量（v/v）将种子培养液分别转接至5份发酵培养基中，37℃、180r/min发酵24h。将发酵液稀释5倍，转移至50mL灭菌离心管，12000r/min、4℃离心10min收集菌体，用等体积预冷的生理盐水（含 1mM PMSF，5mM DTT），12000r/min、4℃离心10min清洗菌体3次，得到新鲜菌泥。

1.2.2 总RNA的提取

与RNA接触的器具均用DEPC水浸泡24h，121℃灭菌30min。菌泥中加入1mL无菌水，转移至1.5mL离心管中，12000g、4℃离心2min收集菌体，弃上清。在研钵中加入液氮，迅速将含有菌泥的1.5mL离心管底部浸入液氮中速冻，保持液氮浴状态，使用一次性组织研磨杵迅速研磨菌体至菌体成粉末状。快速加入1mL Trizol，用移液器反复吹吸至裂解液中无明显沉淀，后续操作详见Trizol使用说明书。用微量核酸蛋白测定仪对总RNA进行浓度值及纯度检测；用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行完整度检测。

1.2.3 反转录cDNA

采用 Takara 公司的 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，操作步骤见说明。所得cDNA立即用于后续实验或于-20℃保存。

1.2.4 实时定量PCR

将实时定量PCR反应体系加入96微孔板中，空白组以ddH2O代替cDNA加入，每个样品3个复孔。加样顺序：SYBR 5μL，上游引物（10μM）0.4μL，下游引物（10μM）0.4μL，cDNA1μL，ddH2O 3.2μL。96孔板用透明膜封好，置于实时定量PCR仪中，按表1所述程序扩增，检测内参及目的基因在样本中的扩增情况。

表1 实时定量PCR反应程序

2 结果与分析

2.1 总RNA检测

提取5组不同处理组中菌体总RNA，测得总RNA的OD260/OD280比值均在2.0左右，证明总RNA纯度较高。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，23S及16S条带清晰完整，总RNA完整性很好。

1，2，3，4，5分别代表发酵液中CaCl2终浓度为0‰，0.05‰，0.1‰，0.15‰，0.2‰的样品

2.2 钙离子对ogdh基因表达的影响

图2A代表CaCl2分别为0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰、0.2‰时GAPDH基因实时定量PCR实验的扩增曲线及熔解曲线 ；B代表CaCl2分别为0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰、0.2‰时ogdh基因定量PCR实验的扩增曲线及熔解曲线

图1 总RNA电泳图

五个不同浓度钙离子处理组目的基因ogdh与内参基因GAPDH的PCR扩增曲线及溶解曲线见图2，扩增曲线光滑，熔解曲线峰单一，说明为特异性扩增。

不同浓度钙离子处理组的ogdh表达水平结果见图3。设定CaCl2浓度为0‰组的ogdh的相对表达量均为1时，可计算出CaCl2分别为0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰、0.2‰时，其ogdh相对表达量之比为：1∶1.672∶2.085∶4.468∶4.518。与CaCl2终浓度为0‰组相比，当Ca2+在发酵培养基中浓度不断升高时，其ogdh基因表达量也随之升高。

3 结论

实验从调控生物酶表达水平角度，研究了钙离子对α-酮戊二酸脱氢酶的调节作用。结果显示，在转录水平上Ca2+提高了编码α-酮戊二酸脱氢酶基因的转录水平，使得酶表达量增加。α-酮戊二酸酶活提高从而加快TCA循环，促进内源谷氨酸合成，最终提高聚谷氨酸产量。

图2-不同处理组GAPDH月ogdh扩普曲线及溶解曲线

图3 不同钙离子浓度下的ogdh相对表达量