响应面法优化草莓酒酿造工艺

孙晓璐，王明跃，张 源

（1.阜阳职业技术学院 生化工程系，安徽 阜阳 236000；2.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037)

发酵果酒的本质上是用酿酒酵母，以天然酵母为辅的微生物代谢的过程，经测定发酵果酒中含有丰富的抗氧化作用成分，这些抗氧化物质与维生素相比，具有更强的抗氧化活性[1]。其中罕有的多酚类成分具有明显的抗氧化性能，例如抗氧化酶、维生素E等物质。草莓果肉中富含丰富维生素C不仅能消除细胞间的松弛，让肌肤处于紧张状态，从而使皮肤紧致，而且对脑和智力发酵有重要影响[2]。目前，江淮流域草莓产业发展迅速，为有效地缓解产量过剩的问题，不少学者对草莓进行了深加工的探究，其中张源等对草莓酒的自然发酵菌种进行了深入研究，并分离出大量利于草莓酒发酵的天然菌株[3]已经应用在草莓酒酿造的产业中。同时具有调节新陈代谢、美容养颜、抗衰老等作用[4]，近年来，刘兴艳等对草莓酒的发酵工艺、澄清工艺等进行了探索，并取得一定成效，为草莓酒的发酵优化了工艺[5]。通过草莓酒酿造过程中的初始糖度、酵母菌接种量和发酵时间几项关键指标做了单因素试验，并通过响应面法优化了试验条件[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草莓鲜果，2019年3月采于阜阳市闻集镇草莓种植基地；白砂糖、安琪酿酒酵母、复合果胶酶（酶活力100 000 U/g）均为市售；硅藻土、二氧化硫、氯化钠、葡萄糖、琼脂等其它生化试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

LRH-100F生化培养箱：上海越特科技有限公司；LB10T糖度计：速为科技公司；电子天平：深圳市华超高科；发酵罐：帝伯仕10 L；无菌取样管，移液器，纱布等。

1.3 试验方法

1.3.1 草莓酒酿酒操作过程

挑选出无破损的草莓、成熟度高，去蒂后，用水清洗、晾干。榨汁后的草莓果浆在28℃条件下，加入果胶酶酶解，根据实验设计进行调整，在通过巴氏灭菌10 min[8]。冷却至常温后，进行恒温发酵，发酵天数为10 d，发酵终止后，进行过滤澄清，放置到5℃条件下进行陈酿15 d[9]。

1.3.2 方法测定

糖度折光仪：测定初始糖度、残糖含量。参照农业部标准NY/T1508-2017《绿色食品果酒》进行感官评定，并根据草莓酒的特性，制定其感官评分标准[10]。由5名专业人员组成评定小组，对果酒的外观，风味、特性进行观察和品尝并打分[11]。

1.3.3 草莓酒发酵单因素试验

将草莓果浆分成三组，在第一组中确定相同的初始糖度，进行相同的发酵时间，酵母接种量分别设定为 0.05%、0.75%、0.1%、0.15%、0.2%的水平下进行取样测定；第二组设置相同的发酵时间，选择相同的酿酒酵母接种量，初始糖量分别为0、5%、12.5%、15%、20%、25%的条件下进行发酵；第三组实验以相同的初始糖度和酿酒酵母的接种量，分别完成发酵液发酵时间为72 h、120 h、168 h、216 h、240 h的相关指标测定，最终确定成品果酒的感官指标。

1.3.4 响应面试验进行草莓酒发酵条件的优化

所有数据进行整理及作图，试验数据用Design expert 8.0统计软件进行响应面法分析，进行并差异显著性检验（P＜0.05）。

设定初始糖度（X1）、酿酒酵母接种量（X2）和发酵时间（X3）3个因素分别为自变量，以感官评分(Y)为响应值，从而确定草莓酒的最佳工艺条件，响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken因素水平表

2 结果与分析

2.1 各因素对草莓酒发酵结果的影响

2.1.1 酵母菌接种量对草莓酒发酵的影响

在草莓酒的发酵过程中，除草莓本身携带的天然酵母外，额外添加的酿酒酵母将对草莓酒的顺利发酵起到一定作用，对草莓酒的口感、风味物质起着重要影响[12]。本实验分别以酿酒酵母接种量为 0.05%、0.75%、0.1%、0.15%、0.2%5个水平做单因素试验，按照1.3.1工艺来进行草莓酒的后续处理，选出比较适合发酵的酿酒酵母接种量。

由表2可以看出，在酿酒酵母接种量为0.05%时，发酵液中残糖含量最高为5.5 g/L，口感中带有甜味，说明在过程中没有将糖分进行彻底发酵，不能作为干酒来饮用，为甜味果酒[13]；当酿酒酵母接种量为0.15%时，残糖含量为3.3 g/L，但是感官评分达到最高，口感最佳，闻之酒香突出，果香浓郁，酒体通透，呈浓郁的红色；继续提高酵母菌的接种量达到0.2%时，残糖含量最少，在发酵初期发酵最为迅速，泡沫产生较多，后期程度急剧下降，发酵最为彻底，但是感官评分较低，由此推测由于酿酒添加量过大，酿酒酵母繁殖迅速，不利于酿酒酵母在后期的持续发酵，导致酒体风味欠佳[14]。因此，酵母的接种量为0.15%时最佳。

表2 不同酵母接种量对酒品质的影响

2.1.2 初始糖度对草莓酒发酵结果的影响

草莓果浆中含有天然葡萄糖、蔗糖、果糖等多种糖分，在进行草莓酒的酿造过程中，酿酒利用糖分转化成为酒精，酒精度的高低将对草莓酒的风味起着重要作用[15]，本实验分别以添加糖量为0、5%、15%、20%、25%5个水平做单因素试验，按照1.3.1工艺来进行草莓酒的后续处理，选出比较适合发酵的初始糖度。

由表3可以看出，当添加糖量为0时，草莓酒中残糖含量为0.5 g/L，说明在草莓果浆中本身含有少量的糖分，这也是能让酒精度达到1.8%vol的原因，但是感官评分最低，并且能闻到异味，这可能是在草莓酒发酵过程中，糖度较低，产生的酒精含量就少，防腐效果较差，其他杂菌容易滋生，产生的邪杂味，导致口感最差[16]。当糖量添加到为20%时，残糖含量比较高达到9 g/L，但是酒精度最高为6.0%vol，感官评分达到85分，酒体清亮，色泽鲜艳，口感较好。

表3 不同初始糖量对酒品质的影响

2.1.3 发酵时间对草莓酒发酵结果的影响

草莓酒的发酵过程很快，在合适的温度下，具备发酵条件时，发酵最快可在72 h完成，但是随着时间的延长，草莓酒开始进入后发酵时期，在一段时间内，代谢产品中的其他副产物也随之产生，这些产品中含有酒体中很多风味物质，有高级醇、酯等复杂成分产生，这也是发酵酒的香味来源[17]。本实验分别以发酵 72 h、120 h、168 h、216 h、240 h 5个水平做单因素试验，按照1.3.1工艺来进行草莓酒的后续处理，选出比较适合发酵的时间。

表4可以看出，当添加糖量为72 h时，草莓酒中残糖含量为5.5 g/L，说明在初期，酿酒酵母就开始繁殖并发酵得到代谢产品，但是酒精度不高为3.0%vol，并且酒体口感较差，感官评分为70分，目测酒体较为浑浊，有明显颗粒物存在[18]。当发酵时间延长到216 h时，感官评分最高为85分，继续发酵至240 h时，酒精度虽然达到比较高的值为6.2%vol，但是口感较216 h时较差，出现了杂味，发酵液上层出现了白色泡沫，随着发酵时间的延长，代谢副产物逐渐增加，使酒体中风味物质发生了变化，从而影响酒体的口感[19]。因此，确定了发酵最佳时间为216 h。

表4 不同发酵时间对酒品质的影响

2.2 响应面法优化草莓酒发酵条件

根据1.3.3中提供的组合设计原理，设计响应面试验因素与水平试验组合。

通过析因实验和中心试验，以析因点为自变量取值在初始糖度X1、接种量X2和发酵时间X3所构成的交互形式，取中心点分别进行3次实验，用来估计实验过程中的误差。进行回归拟合，得二次回归模型为：

由响应面分析得出可决系数R2=0.929 7，方程拟合效果好，误差小，可以用来预测果酒的感官评分。其中X1、X3、X1X3、X12的影响极显著（P＜0.05），说明对感官评分影响较大；发酵时间X3和初始糖度X1对应的平方项X12中P＜0.05对酒精度影响是比较显著的，其中X2X3对感官评分影响效果由于P＞0.05，影响不明显。3个因素分别对草莓酒感官评分的影响为初始糖度大于发酵时间，发酵时间的影响大于酵母接种量，因此，初始糖度对草莓酒的酿造将起着关键性的作用。

由图1可以看出，在所选范围内是存在极点的，其中发酵时间和初始糖度的响应面坡度比较陡峭、等高线偏椭圆，说明发酵时间和初始糖度之间的交互作用显著，对结果影响较大。通过响应面分析软件得出草莓酒酿造最优工艺：初始糖度25%，接种量0.75%发酵时间为240 h，感官评分预测值为90.625。

依照响应面分析给出的实验条件，本实验组以此条件进行了发酵实验，感官评分为88～92之间，平均值为89.2，与预测值比较接近，并且酒体的澄清度比较高，色泽通透鲜艳，酒体果香味明显。酿造果酒的酒体透明度对感官评分起着重要作用[20]。通过响应面分析方法能将草莓酒发酵过程中诸多工艺进行合理优化，通过利用响应面分析方法优化了蜜柚桂圆发酵果酒酿造工艺[21]得出最佳酿造工艺；在通过对草莓酒发酵菌种的筛选及工艺优化的过程中得出结论酵母菌种、发酵温度、菌种添加量的正交试验优化发酵工艺得出果酒感官评分为92.5，酒精度达到12.5%vol[22]。相关数据表明，在草莓酒的发酵过程中，菌种添加量、发酵时间、酿酒酵母的种类及用量对草莓酒的发酵都有显著的影响。

图1 初始糖度、酵母接种量、发酵时间相互作用对草莓酒的影响

3 小结

依照响应面分析给出的实验条件，本实验组以此条件进行了发酵实验，感官评分为88～92之间，平均值为89.2，与预测值比较接近，并且酒体的澄清度比较高，色泽通透鲜艳，酒体果香味明显。在草莓酒的发酵过程中，菌种添加量、发酵时间、酿酒酵母的种类及用量对草莓酒的发酵都有显著的影响，利用响应面法优化草莓酒的发酵条件，得出的相关交互作用的最优条件是可行的，具有实际应用的价值。