快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价

杜清春，董珊珊，丁奕博，张 艳，李 伟，王 鹏

（1. 大理大学公共卫生学院，大理 671000；2. 云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室，大理 671000；3. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206）

炭疽是由炭疽杆菌（Bacillus anthracis，B.anthracis）感染而引起的自然疫源性和人兽共患传染病，炭疽杆菌为革兰阳性杆菌[1-2]。在空气中容易形成芽孢[2-3]，即使在恶劣的环境中依然可以存活数十年甚至更久[4-6]，在条件适宜时重新萌发生长，因此常被用作生物战剂[1-2]。炭疽杆菌的致病因子主要有炭疽毒素和荚膜，分别由炭疽杆菌的质粒pXO1和pXO2编码[1,5,7]。Rayer于1850年在被感染的绵羊血液中发现了炭疽杆菌，它是人类历史上第一个被发现的病原菌[8-9]，其感染人和动物的途径主要有皮肤直接接触感染、消化道感染和呼吸系统感染[9]，人和动物感染炭疽杆菌后的致病类型主要有皮肤炭疽、肠炭疽和肺炭疽。其中皮肤炭疽约占炭疽病的95%左右，是最常见的炭疽病；肺炭疽是最为严重的临床类型，常表现为发热、咳嗽和胸痛等，引起肺功能减退甚至死亡，目前较为少见[10]。检测炭疽杆菌的技术主要有细菌学检测、血清学检测和分子生物学检测[5]。细菌学检测如病原的分离培养和鉴定[11]；血清学检测如荧光量子点免疫标记法[12]、分子生物学检测如环介导等温扩增技术[13-14]、普通PCR扩增技术[15-17]、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）技术等[18,19-22]。

实时荧光定量PCR用于炭疽杆菌的检测，主要依据pagA、cap和rpoB3个靶点基因设计引物和探针。pagA和cap基因分别位于质粒pXO1和pXO2上，在遗传过程中会发生丢失，具有不稳定性；rpoB基因位于炭疽杆菌的染色体上，其基因组序列和蜡样芽孢杆菌高度相似，会有交叉反应[23]，不宜用于炭疽杆菌的检测。虽然血清学方法为炭疽的主要诊断技术，但其特异性和灵敏度相对于RT-PCR技术不占优势，且血清学方法在炭疽感染初期不易检出抗体。基于以上情况，本研究根据位于炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点设计引物和探针，以期建立能在感染初期特异检出炭疽杆菌的方法。

1 材料与方法

1.1 阳性菌株和阴性菌株DNA实验中所用到的10份炭疽芽孢杆菌DNA（其中A16R为疫苗株，其余9份为标准株）由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供；阴性对照菌株DNA由云南省地方病防治所中心实验室保存。阴性对照菌株信息见表1。

表1 阴性对照菌株Table 1 Negative control strains

1.2 主要试剂TaqProbe qPCR 2 × real-time Mix、细菌DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；炭疽杆菌（cap/rpoB/pag）单重荧光PCR检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

(续上表)

1.3 实验方法利用4对引物检测10份炭疽杆菌DNA和对照菌株DNA，再进行灵敏度的检测，最后选择分别针对TJHP和BA5345 2个靶点且特异性和灵敏度较好的2对引物及其探针进行重复性实验。同时用炭疽杆菌（cap/rpoB/pag）单重荧光PCR检测试剂盒做对比试验。根据扩增曲线和Ct值评价所选择的2对引物及其探针的特异性和灵敏度，建立快速检测炭疽杆菌的方法。

1.3.1 设计并合成引物和探针 根据炭疽杆菌染色体上的2个靶点TJHP和BA5345碱基序列，运用Primer Premier 5.0软件分别设计4对引物和2个探针，并送至上海辉睿生物科技有限公司合成。引物和探针序列见表2。

表2 4对引物及其探针序列Table 2 Primer and probe sequences

1.3.2 提取细菌DNA 按细菌DNA提取试剂盒操作说明提取炭疽杆菌和阴性对照菌株DNA。

1.3.3 建立快速检测炭疽杆菌的qPCR反应体系 反应体系：2×real-time Mix 10 μL，ddH2O 6.8 μL，上下游引物和探针（浓度均为0.1 nmol/μL）各0.4 μL，模板DNA 2 μL。扩增条件：95℃变性2 min；95℃变性20 s，60℃延伸30 s，共40次循环。反应完成后，分析扩增曲线和对应Ct值。

1.3.4 特异性检测 利用4对引物分别检测10份炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA，根据扩增曲线和Ct值评价4对引物的特异性。同时用传统的炭疽杆菌（cap/rpoB/pag）单重荧光PCR检测试剂盒做对比试验。

1.3.5 灵敏度检测 选择含量最多的1份炭疽杆菌DNA（其浓度为45.13 ng/μL），按10倍倍比稀释，稀释成100～10-910个浓度，利用4对引物对稀释的炭疽杆菌DNA进行检测。

1.3.6 重复性实验 在同一实验条件下，挑选特异性和灵敏度较好的2对引物进行重复检测，比较分析两次实验结果差异。

2 结果

2.1 特异性检测结果

2.1.1 阳性菌株DNA检测结果 4对引物及其探针的特异性良好。其Ct值和扩增曲线，见表3和图1。

2.1.2 传统炭疽杆菌（cap/rpoB/pag）单重荧光PCR检测结果 对同一份炭疽杆菌DNA进行检测时，cap/rpoB/pag3个靶标的Ct值分别为26.61/ 35.01/36.55，其中rpoB基因对蜡样芽胞杆菌DNA有非特异性扩增。

表3 4对引物检测10份炭疽杆菌DNA的Ct值Table 3 Ct value of 10 Bacillus anthracis DNA detected

2.1.3 阴性对照菌株DNA检测结果 4对引物对阴性对照菌株DNA均不扩增；rpoB基因与蜡样芽孢杆菌有交叉反应。部分扩增结果如图2所示。

2.2 灵敏度检测结果在检测炭疽杆菌TJHP和BA5345靶基因的引物中，FP2/RP2和FP4/RP4灵敏度较好，其2对引物均在10-5稀释度时几乎无扩增，在10-4稀释度时还能扩增，2对引物能检测到的最低DNA浓度约为4.513×10-5ng/μL（图1）。

图1 4对引物检测10份炭疽杆菌DNA的扩增曲线Fig.1 Ampli fication curves of 10 Bacillus anthracis DNA detected with 4 primers

2.3 重复性试验结果两次实验结果一致，对两次结果的Ct值进行完全随机设计两样本均数比较的t检验，得到t=1.178，P=0.332，按а=0.05检验水准，P＞0.05，接受H0，拒绝H1，差异无统计学意义，可认为两次实验结果无明显差异，表明所建立的快速检测方法稳定性良好。

图2 灵敏度实验中的部分扩增曲线Fig.2 Partial ampli fication curve of negative control strain ropB gene detected with primer FP4/RP4

图3 FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度扩增曲线Fig.3 The sensitivity ampli fication curve of primers FP2/RP2 and FP4/RP4

3 讨论

炭疽杆菌的致病因子主要是炭疽毒素和荚膜，分别由质粒pXO1和pXO2编码，故检测炭疽杆菌的基因诊断技术主要依据这两个质粒的pagA和cap基因设计引物和探针。而本次检测方法的建立主要根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点共设计4对引物和2条探针。若所设计的引物和探针在现场样品的筛查中能特异地检出炭疽杆菌，则又进一步丰富了炭疽的检测技术，这对于炭疽的防治工作具有重要意义。

目前，检测炭疽杆菌的技术主要有细菌学检测、血清学检测和分子生物学检测[24]。虽然分离到病原是诊断的金标准，但细菌学检测有耗时长、病原分离率低等不足，不利于临床医师做出快速确诊，故临床检测中已较少使用，现主要用于流行病学追踪调查等科研活动；血清学检测是现阶段用于检测炭疽杆菌的主要筛查检测技术，但其特异性相对较弱且灵敏度低，在感染初期因抗体效价低不易检出，容易出现假阳性或假阴性；分子生物学检测起步相对较晚，但经过二十多年发展已逐渐成熟，PCR技术因其特异性强、灵敏度高，在科学研究中已被广泛应用[25-27]。其中具有代表性的RT-PCR，不需要像普通PCR进行凝胶电泳，降低了被污染的机率，并且缩短了检测时间，能在2 h之内检出结果，大大提高了检测效率。

在实际检测中，由于RT-PCR灵敏度高、特异性强的特点，可能会出现检测结果与其他方法不一致的情况，如RT-PCR为阳性，而血清学为阴性[28-29]。此时，不应以某一检测方法的结果为最终结果，而要结合多种检测方法的检测结果作出正确的结论。

从检测结果可以得知，4对引物对10份炭疽杆菌DNA均能特异性扩增，而对阴性对照菌株DNA无扩增，其特异性强于传统的基因检测试剂盒；FP2/RP2和FP4/RP4灵敏度较好，且重复性好（t=1.178，P=0.332），建立的快速检测方法稳定性良好。因此，这2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断；也可用于炭疽疫情监测中土壤、粪便、毛皮制品等批量样本的快速筛查。