羊口疮病毒疫苗株和野毒株F1L基因的比较分析

王文莉，魏楠楠，徐守兴，卢炳洲，张大俊，张克山，郑海学，刘湘涛

（1.甘肃省动物疫病预防控制中心，兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室 国家口蹄疫参考实验室，兰州 730046）

羊口疮（Orf），又名羊传染性脓疱、羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎[1-2]，是由痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属的典型代表羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）[3-4]引起的，主要通过破损的皮肤及黏膜感染，引起的绵羊、山羊以及人的一种急性高度接触性人兽共患传染病，也会感染其他野生反刍动物如鹿、麝牛等。临床表现以口、舌、鼻、唇、乳房等部位的皮肤和黏膜形成水疱、脓疱、溃疡和结痂为特征，主要引起皮肤和黏膜的增生性病变[5-7]。严重影响动物的生长发育，甚至引起继发性感染，病死率可达20%～50%。ORFV在世界范围内广泛流行，给养殖业造成巨大经济损失，同时严重威胁着人类的健康。

研究表明，羊口疮病毒基因组为线性双链DNA，大小为130～150 kb，中央编码（ORFVs009-111）较为保守。Orf059（F1L）基因是ORFV基因组的第59个开放阅读框，位于基因中部高度保守的区域，编码产生的39 kDa蛋白是病毒表面微管的组成成分之一，并且能诱导宿主产生中和抗体[8]。该蛋白具有肝素结合活性，能够与大多数哺乳动物细胞表面表达的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）受体结合，认为该蛋白在病毒的吸附和侵入过程中起着重要作用[9]。同时该蛋白还是ORFV囊膜蛋白的重要组成成分，是刺激机体产生免疫应答的主要抗原蛋白之一，能够介导细胞免疫和体液免疫[10]。因此研究F1L蛋白对羊口疮的诊断和免疫具有重要意义。

目前，用于防控ORFV疫苗是弱毒疫苗。疫苗株和野毒株的F1L基因差异尚不清楚，本研究扩增并测定了野毒株与疫苗株ORFV的F1L基因序列，并对不同毒株间的F1L的核苷酸序列、推导的氨基酸序列以及蛋白质结构进行比较分析。该研究结果为进一步深入研究ORFV的分子机制提供了依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源疑似感染口疮病毒的羊唇部痂皮、病料由某羊场提供。

1.2 材料疫苗、DNA提取试剂盒、ExTaqDNA聚合酶以及dNTP采购自TaKaRa公司，引物由金唯智生物公司合成。

1.3 引物的设计合成根据GenBank中公布的F1L基因序列（GenBank登录号：KP339950.1）并参考文献设计1对特异性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1：5'-ATGGATCCACCCGAAATCAC- 3'；下游引物P2：5'-TCACACGATGGCCGTGACCA- 3'。

1.4 病毒DNA的提取及PCR的扩增按照DNA提取试剂盒的操作说明进行DNA的提取，并于-20℃保存。反应体系（50 μL）：5×PCR buffer 10 μL，premerstar 酶0.5 μL，模板1 μL，P1/P2（10 pm/L）各1μL，dNTP 5μL，补ddH2O至50 μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性50 s，56.5℃退火50 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.5 序列测定及其分析将电泳检测片段大小合适的扩增产物送去测序。利用DNAStar、DNAMAN等软件进行疫苗株和分离株序列的比对，分析F1L基因在核苷酸和氨基酸水平上的变异情况；将测定后的序列与GenBank上已公布的F1L基因序列进行比对分析；采用在线工具对测定的疫苗株及分离株F1L基因序列进行结构预测，并分别对F1L基因编码的蛋白质一、二、三级结构进行比较分析。

1.6 蛋白质一级结构与功能的比较分析运用Expasy在线工具包中的ProtParam分析ORFV疫苗株和野毒株编码的F1L蛋白的氨基酸组成及各种理化性质；利用DNAStar软件的Kyte Doolittle 方法预测其亲水性及疏水性；利用TMHMM 2.0和Expasy中的Signal IP分析工具预测其跨膜区以及信号肽。

1.7 蛋白质二级结构与功能的比较分析用DNAStar软件对疫苗株和分离株的F1L蛋白结构进行预测。依据其亲水性、表面可能性分析以及抗原指数分析结果预测其可能的抗原表位。

1.8 蛋白质三级结构分析将疫苗株与分离株的F1L基因推导的氨基酸序列提交到Swiss-Model进行三维结构的预测，并用Swiss-PDB-Viewer软件进行分析。

2 结果

2.1 F1L基因的扩增应用F1L基因特异性引物，以提取的病毒DNA为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现了1条约1000 bp DNA片段，与预期大小相一致。

2.2 序列测定和分析用DNAMAN软件对测序所得的疫苗株和分离株F1L基因核苷酸序列进行比较分析。结果显示：两者的核苷酸序列同源性为95.9%，共发现42处变异。运用BLAST软件，将2个序列与GenBank上同属的其他毒株进行核苷酸序列同源性比较（表1），发现本次测定的ORFV疫苗株、分离株F1L基因的核苷酸序列和氨基酸序列与其他毒株的相似性分别为96.4%～97.5%，97.8%～99.1%。通过系统进化树分析发现，本次测定的ORFV分离株F1L基因核苷酸与2015年公布的毒株KP339950.1同源性最高，同时与毒株KP339949.1以及KX029229.1较为接近，处在同一进化分支上（图1）。

表1 ORFV分离株F1L基因核苷酸和氨基酸同源性分析Table 1 Nucleotide sequence homology and amino acid sequence homology analysis of F1L gene of ORFV isolates

图1 ORFV不同毒株编码的F1L基因系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of F1L gene of ORFV isolates

2.3 蛋白质性质、结构与功能分析

2.3.1 蛋白质一级结构及理化性质分析 将疫苗株和分离株推导的氨基酸序列提交在线工具Expasy，可知疫苗株和分离株F1L蛋白的相对分子质量分别为37266.40和37574.86 Da，理论等电点分别为5.67和5.68。疫苗株编码的F1L蛋白因突变后酪氨酸残基减少，摩尔消光系数减少。疫苗株与分离株F1L蛋白均为疏水性不稳定蛋白，平均亲水性指数分别为0.073和0.111，不稳定指数分别为48.82和46.85。利用TMHMM 2.0分析可知，疫苗株和分离株F1L蛋白均在282～304和311～333共有2个跨膜区（图2）。SignalP 4.1分析表明疫苗株和分离株F1L蛋白都无信号肽。

图2 F1L蛋白跨膜区预测Fig.2 Prediction of transmembrane region of F1L protein

2.3.2 蛋白质高级结构及功能分析 运用DNAStar软件预测疫苗株和分离株的二级结构（图3），结果显示两者蛋白形成的α螺旋和β折叠较多，这可能与该蛋白的氨基酸组成有关。其中疫苗株比分离株多1个α螺旋，多3个β折叠。疫苗株F1L蛋白在3～17 aa区段为β折叠，而分离株在该区段3～8 aa区段为α螺旋，8～15 aa区段为β折叠。将推导的疫苗株与野毒株F1L蛋白序列提交到Swiss-Model进行三维结构的预测（图4），可以看出疫苗株和野毒株F1L蛋白的三维结构有明显差异，分离株在130～180 aa、230～270 aa区段比疫苗株多了无规则卷曲区域。

图3 ORFV疫苗株（上图）与分离株（下图）F1L蛋白二级结构预测Fig.3 Secondary structure prediction of ORFV vaccine strain (the figure above) and isolated type strain (the following figure) F1L protein

3 讨论

羊口疮是一种高度接触性急性人兽共患病，传播范围广，该病常为群体发病，尤其是密集的羊群。给养羊业造成巨大的经济损失，同时也直接威胁着人类健康[11]。近几年来ORFV感染的宿主范围在逐渐扩大，除了感染小反刍兽外，驯鹿、麝牛等也可感染。目前该病的发病率及感染程度均较以往有所增强。

图4 ORFV疫苗株（A）和分离株（B） F1L 蛋白结构域三维结构预测图Fig.4 Three-dimensional structure prediction of ORFV vaccine strain (A) and isolated strain (B) F1L protein

疫苗接种为有效控制该病发生的手段。弱毒苗是国内外进行常规免疫的首选。在一定程度上这些疫苗能有效的降低感染率。然而，近年来有研究报道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保护，出现免疫失败和重复感染[12]。

本研究以疫苗株和分离株病毒提取到的基因组DNA为模板扩增F1L基因，测序后对比分析二者的结构和序列。发现疫苗株和分离株F1L基因在核酸水平和蛋白水平均存在一定的差异。疫苗株和分离株F1L基因在同一区段有2个跨膜区，亲水性区域相同且都无信号肽，但二者的理论等电点、相对分子质量不同。预测的二级结构中疫苗株比分离株多1个α螺旋，多3个β折叠，可能 B细胞表位也有差异。蛋白二级结构中α螺旋、β折叠的键能较高，能牢固的维持蛋白的高级结构，但很难较好的与抗体嵌合，并经常位于蛋白质的内部，因而很少成为抗原表位。预测的三维结构在N末端有明显的区别，应该是一、二级结构变化导致三级结构的差异。

F1L蛋白是ORFV重要的保护性抗原蛋白，具有良好的免疫原性，可以刺激机体产生中和抗体。F1L基因的序列遗传进化分析能够为ORFV的流行病学研究提供一定的参考。对F1L基因及其编码蛋白的研究有助于阐明ORFV的致病机制，并且也为羊口疮的有效防控措施的制定提供重要的理论依据。

本研究通过对ORFV疫苗株与分离株F1L基因进行比较分析，发现他们在一、二、三级结构存在差异。该研究结果为F1L蛋白功能研究提供了线索，同时也为ORFV弱毒活疫苗致弱机制是否与该基因的变化有关提供了研究切入点和可能性。