不同品系甘孜州梨果仙人掌果多糖的含量及初步生物活性研究

邓海云 夏陈 李燕君 邓俊琳

摘 要：目的：比较不同品系甘孜州梨果仙人掌果果皮和果肉多糖的抗氧化活性及体外对α-葡糖糖苷酶活性的作用。方法：将新鲜仙人掌果果皮和果肉分离、干燥、打粉、热水浸提、过滤、80%乙醇醇沉、脱蛋白、脱色、透析、旋转蒸发浓缩。苯酚-硫酸法测定多糖含量，并通过羟自由基清除实验、还原力实验（FRAP）、ABTS清除实验测定多糖抗氧化活性，测定其对α-葡萄糖苷酶的作用。结果：品系1、2梨果仙人掌果果肉多糖含量分别为6.59±0.12、6.95±0.28g/100g，品系1、2果皮的多糖含量分别为5.53±0.22、6.46±0.18g/100g;品系1、2对ABTS自由基清除能力的IC50分别是果肉0.23、0.60mg/mL和果皮0.85、0.88mg/mL，品系1果肉多糖的IC50值最小（P<0.05）;品系2果肉多糖还原力较强（P<0.05）;品系2果皮多糖有较强的羟自由基的清除能力和较强的α-葡萄糖苷酶促进作用（P<0.05）。结论：两品系梨果仙人掌果多糖含量较高（5%～7%）且无差别。两品系梨果仙人掌果多糖都表现出一定的抗氧化能力和对α-葡萄糖苷酶活性的促进作用。

关键词：梨果仙人掌果;多糖;抗氧化性;α-葡萄糖苷酶活性

近年来，植物多糖备受研究者关注，现有研究证明，仙人掌果中所含的多糖类物质具有抗肿瘤[1-4]、降血脂[5]、降血压[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、抑制菌生长和调节免疫[9]等功能。四川甘孜仙人掌果水分含量充足，食用时口感香甜，但目前未见对甘孜州梨果仙人掌果多糖的含量、理化性质及生物活性研究。本文选用甘孜两种不同品系梨果仙人掌果（图1，a为品系1，果实圆实;b为品系2，果实细长），研究其多糖含量和多糖抗氧化活性并作比较，且初步探讨梨果仙人掌果多糖对α-葡萄糖苷酶的作用，为将梨果仙人掌果开发成具有保健功能的增值产品提供科学依据，服务民族地区特色经济作物的开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

品系1和品系2梨果仙人掌果（康定市姑咱镇），由四川省甘孜农科所提供。α-葡萄糖苷酶（北京索莱宝生物科技有限公司）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（北京索莱宝生物科技有限公司）、木瓜蛋白酶（北京奥博星生物技术有限责任公司）、AB-8大孔树脂，抗坏血酸、柠檬酸、柠檬酸钠、水杨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、多聚甲醛、硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾、三氟乙酸、氯仿、氯化亚铁、菲洛嗪、正丁醇均为分析纯试剂。

1.2 仪器

FA2104型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司;FW-100高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司;TD-4Z型台式低速离心机，四川蜀科仪器有限公司;KH2200DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司;ELX-800型号酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;UV-6100型号紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司;PHS-3C型酸度计，上海科佑仪器仪表有限公司。

1.3 仙人掌果多糖的提取及含量测定

去除梨果仙人掌果表面的毛刺，分离果皮和果肉，50℃烘干，打粉，过60目筛，得到仙人掌果果皮和果肉粉末样品。称取一定质量样品，按料液比1∶15加入蒸馏水，70℃热水浸提2h，重复提取2次[10]，以8 000r/min离心10min，合并上清液，旋转蒸发浓缩，80%的乙醇醇沉，用无水乙醇洗涤3次，得到粗多糖。然后将粗多糖用Sevag法脱蛋白，AB-8大孔树脂脱色，透析法去除低聚糖、盐类等小分子杂质，得到初步纯化的梨果仙人掌多糖浓缩液。

1.4 仙人掌多糖含量的测定

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。参照文献[10]方法，并作适当修改。取多糖浓缩液0.1mL于15mL试管，并加蒸馏水补充到1mL，加入6%的新蒸苯酚溶液0.5mL，摇匀后并加入2.5mL的浓硫酸，摇匀后放置5min，然后沸水浴15min，冷却至室温后，于490nm处测定吸光度值。按照同样方法繪制葡萄糖标准曲线，得到回归方程为A=0.0038C+0.0045，R2=0.999（A为吸光度值，C为葡萄糖质量浓度，μg/mL）。多糖得率计算公式为式（1）：

梨果仙人掌果多糖得率（%）=C×E×VW×106×100（1）

式（1）中，C为样品多糖浓度（μg/mL）;E为稀释倍数;V为样品提取液体积（mL）;W为样品质量（g）。

1.5 仙人掌果多糖抗氧化活性的测定

1.5.1 对羟自由基的清除能力测定 参照文献[12]中的方法，并作适当修改。向10mL试管中以此加入9mmol/L的FeSO4溶液1mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL，一定浓度的多糖溶液2mL（0.25、0.5、1、2、3、4mg/mL），然后加入8.8mmol/L H2O2溶液2mL启动反应，室温下反应1h，在510nm处测定吸光度值，实验重复3次，以维生素C为阳性对照。清除率计算公式为式（2）：

羟自由基的清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100（2）

式（2）中，A0为空白对照组吸光度值（以去离子水代替多糖溶液）;A1是实验组吸光度值;A2是样品本底吸光度值（以去离子水代替H2O2）。

1.5.2 还原能力测定 参照文献[13]中的方法，并作适当修改。取不同浓度多糖溶液0.2mL（0.5、1、2、3、4、5mg/mL）置于5mL离心管中，并依次加入0.2mol/L（pH=6.6）的磷酸盐缓冲液0.5mL、1%铁氰化钾溶液0.5mL，混匀后，50℃恒温水浴20min，取出冷却至室温，加入10%三氯乙酸溶液0.5mL，再次混匀，3 000r/min离心10min，取上清液1.25mL于试管，并加入蒸馏水1.25mL、0.1%三氯化铁溶液0.5mL，摇匀后静置10min，在700nm波长处测定吸光度值，以蒸馏水作空白参比，实验重复3次。

1.5.3 ABTS清除能力测定 参照文献[14]中的方法，并作适当修改。将ABTS溶液和过硫酸钾溶液混合，使混合液中ABTS浓度为7mmol/L、过硫酸钾浓度为2.45mmol/L，在室温下，将混合液避光孵育16h，然后用PBS（pH=7.0）稀释混合液，使混合液在734nm波长处吸光度值为0.70±0.02，得到ABTS工作液。将一定浓度的多糖溶液（0.25、0.5、0.75、1、1.25、2.5mg/mL）和ABTS工作液以1∶1混合，室温下孵育6min，在734nm波长处测定吸光度值，实验重复3次。

1.6 仙人掌果多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

参照文献[14]中的方法，并作适当修改。向96孔板分别加入80μL不同浓度多糖溶液（0.1、0.5、1、2、4、6mg/mL），再向每孔中加入20μL α-葡糖糖苷酶液（2.5 U/mL，用0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液配制），37℃孵育10min，迅速向各孔加入20μL PNPG溶液（20mmol/L，用0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液配制），37℃孵育10min，向每孔中加入160μL碳酸钠溶液（0.2mol/L）终止反应，用酶标仪在405nm波长下检测定吸光度值。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率计算公式为式（4）：

酶活性抑制率（%）=（1-A1-A2A0）×100（4）

式（4）中，A0为空白对照组吸光度值（以蒸馏水水代替多糖溶液）;A1是实验组吸光度值;A2是样品本底组吸光度值（以磷酸盐缓冲液代替α-葡糖糖苷酶液）。

1.7 数据分析

用SPSS 21.0软件对实验数据进行分析，结果以平均值和标准差表示（正态分布），或以中位数和四分位数表示（非正态分布），多组间比较用单因素方差分析和两两比较用LSD检验，检验水平为0.05，用OriginLab 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 多糖含量

如表1所示，4组样品多糖含量具有统计学差异（F=8.789，P=0.031），在品系1仙人掌果中，果皮多糖含量低于多肉（P=0.021），而品系2仙人掌果果皮和果肉多糖含量无统计学意义（P=0.165），两品系仙人掌果果肉多糖含量无差别（P=0.286），而品系1果皮多糖含量相对较低（P=0.032）。4个样品多糖含量都在5%～7%内。分别是品系1、2梨果仙人掌果果肉多糖含量分别为6.59±0.12、6.95±0.28g/100g，品系1、2果皮的多糖含量分别为5.53±0.22、6.46±0.18g/100g。传统的梨果仙人掌果的食用方法是只食用果肉，丢弃质量比较大的果皮部分，造成资源的浪费，可以将果皮部分作为多糖提取的原料。

2.2 对羟自由基的清除能力

羟自由基是活性氧中对人体危害最大的一种自由基，可以引起大多数生物大分子发生氧化反应，导致细胞氧化损伤，甚至死亡。如图2a所示，4种样品的多糖对羟自由基的清除能力表现出剂量反应关系，剂量越大，清除能力越强，在多糖浓度为2～4mg/mL范围内，品系2果皮多糖具有较高的羟自由基清除能力（P<0.05）。在多糖浓度为4mg/mL时，品系1果肉多糖、品系2果肉多糖、品系1果皮多糖、品系2果皮多糖的羟自由基清除率分别为28.3%、31.4%、21.4%、39.0%。清除羟自由基的机制有多种，例如抑制过氧化物的生成、分解，降低羟自由基的生成。而多糖清除羟自由基的作用机制可能是通过与自由基结合，终止自由基引起的链式反应[16]。

2.3 还原能力（FRAP）

活性物质可以提供电子与自由基反应生成稳定的化合物，生成物越多，吸光度值越大，物质还原力越强。如图2b所示，4种样品多糖的还原力比较接近，总体表现出剂量反应关系，在多糖浓度为5mg/mL时，品系1果肉多糖、品系2果肉多糖、品系1果皮多糖和品系2果皮多糖的吸光度值分别为0.20、0.25、0.16、0.19，品系2果肉多糖的还原力较强（P<0.05）。

2.4 ABTS清除能力

如图2c所示，4种样品多糖和维生素C（VC）对ABTS自由基具有较强的清除能力，表现出明显的剂量反应关系，对比4种仙人掌多糖样品，在多糖浓度为0～1.25mg/mL范围内，品系1果肉多糖具有较高的ABTS自由基清除能力，仅比维生素C的清除能力稍弱。维生素C、品系1果肉多糖、品系2果肉多糖、品系1果皮多糖和品系2果皮多糖对ABTS自由基清除能力的IC50分别是0.26μg/mL、0.23mg/mL、0.60mg/mL、0.85mg/mL、0.88mg/mL。在样品浓度为2.5mg/mL时，5种物质对ABTS自由基清除能力达到最大值，即维生素C（95.9%）、品系1果肉多糖（92.7%）、品系2果肉多糖（91.8%）、品系1果皮多糖（88.6%）、品系2果皮多糖（94.2%）。品系1、2果肉多糖和果皮多糖对ABTS自由基的最大清除能力无差异（P>0.05）。

2.5 对α-葡萄糖苷酶活性作用

如图2d所示，4种样品多糖对α-葡萄糖苷酶活性表现出明显的促进作用，并且存在一定的剂量反应关系，在4种样品多糖中，品系2果皮多糖对α-葡萄糖苷酶活性有较强的促进作用（P<0.05），在多糖濃度为6mg/mL时，品系1果肉多糖（酶促活性最大值35.7%）、品系2果肉多糖（酶促活性最大值55.3%）、品系1果皮多糖（酶促活性最大值60.9%）和品系2果皮多糖（酶促活性最大值85.0%）对α-葡萄糖苷酶的促进作用几乎达到最大值。有研究表明，植物多糖降血糖的机制十分复杂，可以促进胰岛素的分泌[17];通过清除自由基，保护胰岛β细胞[18];调节糖代谢相关酶活性，促进肝糖原合成[19];调节免疫功能，改善糖尿病症状[20];抑制升血糖激素分泌等[21]。不同的植物多糖其降血糖机制可能不同，研究发现，茶叶多糖可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，但是银耳、灵芝等多糖可以促进α-葡萄糖苷酶活性，与本次研究结果相同。高洁等[22]通过给糖尿病大鼠饲喂仙人掌果多糖提取液，发现其具有降血糖作用，并且可以明显改善糖尿病大鼠的症状，推测仙人掌果多糖可以保护胰岛β细胞。刘华钢等[23]研究发现，仙人掌果多糖可以促进糖尿病大鼠胰岛素的分泌，达到降血糖的作用。

3 结论

品系1和品系2梨果仙人掌果的多糖含量都在5%～7%内，且差别较小，果皮和果肉所含的多糖相当，可以在食用果肉的基础上，加大对果皮的开发利用。在抗氧化性实验中，品系1和品系2的果肉、果皮4种样品的多糖都表现出一定的羟自由基清除能力、还原力和较高的ABTS自由基清除能力;其中品系2果肉多糖的还原力较强，品系1果肉多糖具有较高的ABTS自由基清除能力（IC50为0.23mg/mL）。4种样品多糖对α-葡萄糖苷酶活性表现出明显的促进作用，其中品系2果皮多糖对α-葡萄糖苷酶活性最强（酶促活性最大值85.0%）。根据研究结果，加之梨果仙人掌果本身富含蛋白质、维生素、矿物等营养物质，提示可以将其开发为平衡降血糖或其他健康功能的功能食品。◇

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