雷公藤内酯醇对类风湿关节炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路的调控作用研究

陈颖婷，何柯新，王云秀，何 敏△,郑智明

(1.广东省中医院检验科，广东广州 510120；2.广州市惠爱医院检验科，广东广州 510108)

类风湿性关节(RA)在临床上未能明确其发病机制，但是作为全身性、慢性、涉及身体免疫功能的疾病，具有高风险致残率，严重威胁现代人的生活。RA易引起侵袭性、对称性、小关节多关节炎症的发生，临床表现多样复杂[1-2]。西药多采用非甾体抗炎药、改善病情的抗风湿药、糖皮质激素和生物药物进行治疗，治疗期间需要长期坚持并与其他药物联合使用，由于RA病情的复杂性，导致用药时需要多方位联合用药，较为麻烦，很难长期坚持，不利于患者的病情发展[3-4]。中医遵循辨证论治，从多角度治疗RA，认为RA的发生与正气、营卫及风寒湿三者相关，多采用扶正祛邪、活血养阴、祛风除湿等中药进行治疗。雷公藤是在临床上对RA具有肯定疗效的中药，具有祛风除湿、通络止痛、消肿止痛、解毒杀虫等功效，其中的有效成分环氧二萜内酯化合物——雷公藤内酯醇，实验证实其具有抗炎和免疫抑制的作用，但关于其治疗机制的研究仍需深入研究[5-6]。本研究通过Toll-样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路和炎症表现为切入点，观察雷公藤内酯醇的药效，并探索其具体作用基础。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物SPF级SD大鼠，体质量(200±10)g，购自广州中医药大学试验动物中心，合格证号： SYXK(粤)2013-0001。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 酶标仪购自美国Bio-Rad公司，显微镜购自日本Olympus公司，LDZ5-2 型离心机购自北京离心机厂，RM2015 型切片机购自德国Leica公司，多功能真彩色细胞图象分析管理系统购自美国Media Cybernetics公司。

1.2.2试剂 雷公藤内酯醇购自中国药品生物制品鉴定所，双氯芬酸钠肠溶片(批准文号H11021540)购自北京诺华制药有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，热杀死结核分枝杆菌购自Difco实验室。大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-4、IL-6 ELISA法检测试剂盒购自深圳宝安康生物公司。TLR-4 抗体(批号：dw253469)、NF-κB(p65)抗体(批号：dw016352)、p-NF-κB(p65)抗体(批号：ap160988)均购自Abcam公司。Trizol(批号：122041)购自 Invitrogen 公司。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(批号：AK3711)、SYBR Premix Ex TaqTM(批号：AKA2451)均购自 Takara 公司。

1.3方法

1.3.1动物分组 24只SD大鼠适应性喂养7 d后，保持25 ℃室温和75%湿度，将动物随机分成空白对照组、RA模型组、阳性药双氯芬酸组、雷公藤内酯醇组，每组6只。

1.3.2RA大鼠模型制作 RA模型组、阳性药双氯芬酸组、雷公藤内酯醇组大鼠腹腔注射10%水合氯醛全身麻醉后，固定到手术台上，呈现仰卧位，固定头部及四肢。在已消毒的大鼠尾根部皮下注射0.2 mL热杀死结核分枝杆菌(5 mg/mL)，然后用消毒棉球压住注射部位，防止药物渗出和止血。注射位置不渗液后，松开固定的绳子和板，放于笼中让其自然苏醒和自由活动。

1.3.3给药 造模成功后，阳性药双氯芬酸组大鼠给予双氯芬酸(10 mg/kg)灌胃，每日1次；雷公藤内酯醇组大鼠给予雷公藤内酯醇(6 mg/kg)灌胃，每日1次；空白对照组和RA模型组大鼠给予等量0.9%生理盐水灌胃，每日1次，共给药3周。

1.3.4炎性细胞因子表达水平检测 灌胃3周后，乙醚轻麻醉大鼠，取各组大鼠眼底静脉丛血浆1 mL，通过低温高速离心机设定4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液。按照大鼠TNF-α、IL-4、IL-6 ELISA试剂盒的说明书操作，于酶标仪测定450 nm波长处吸光度(A)值。以标准品浓度的对数为横坐标、测定的A值为纵坐标绘制标准曲线，公式计算血清TNF-α、IL-4、IL-6表达水平。

1.3.5关节炎指数和足体积测量 利用四肢的病变程度累积计分，计算出关节炎指数。若无红肿，得0分；小趾关节轻度红肿，得1分；小趾关节和足跖肿胀，得2分；踝关节以下的趾甲肿胀，得3分；包括踝关节在内的全部趾甲、关节肿胀，得4分。每4天评价1次，共观察20 d。用足趾容积测量仪测量大鼠的足体积，每4天测量1次。共观察20 d。

1.3.6TLR4、NF-κB、p-NF-κB免疫组织化学检测 取各组大鼠受试部位膝关节滑膜组织，进行固定切片，切片进行脱蜡、入水、热修复抗原后，冷却至25 ℃室温，PBS洗涤3次，加入封闭液，室温放置20 min后，先后滴加一抗(稀释比例为1∶100)和二抗生物素化(IgG)，并在切片上依次加入辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)、DAB显色、苏木素轻度复染，并进行脱水、透明、封片，运用图象分析管理系统分析，计算出平均A值。

1.3.7受试关节滑膜组织TLR4 mRNA检测 取各组大鼠关节滑膜组织各100 mg，通过Trizol试剂盒提取总RNA，经核酸蛋白检测仪确认无污染，逆转录，采用TakaRa公司的Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒及SYBR Premix Ex TaqTM合成模板cDNA和扩增目的基因cDNA片段，TLR4上游引物5′-CTC ACA AAC TCA GTG GCT GGA TTT A,下游引物3′-GTC TGG TCC CAC CAG ATT CTC，179 bp；GAPDH上游引物5′-GAC ATG AAT GGC ATC GTG GA，下游引物3′-ATG CAG GGA TGA ACA ACT GG，142 bp。扩增结束后以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt公式计算目的基因的相对表达量。

2 结 果

2.1血清炎性细胞因子表达水平比较 与空白对照组相比，RA模型组血清中 TNF-α、IL-4、IL-6表达水平显著升高(P<0.01)；与RA模型组比较，阳性药双氯芬酸组血清中TNF-α、IL-4、IL-6表达水平下降(P<0.05)，且雷公藤内酯醇组TNF-α、IL-6表达水平显著下降(P<0.01)。见表1。

2.2大鼠关节炎指数和足体积比较 造模后，大鼠关节出现肿胀和组织浸润，形成高透明度。与RA模型组比较，雷公藤内酯醇组在第8、12、16、20 天时关节炎指数和足体积降低(P<0.05)，阳性药双氯芬酸组在第12、16、20 d时关节炎指数和足体积降低(P<0.05)。见表2、3。

2.3各组TLR4、NF-κB、p-NF-κB免疫组织化学检测结果比较 与空白对照组比较，RA模型组TLR4、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表达量升高(P<0.05)。与RA模型组比较，阳性药双氯芬酸组滑膜组织中TLR4、 NF-κB蛋白表达量下降(P<0.05)，雷公藤内酯醇组膜组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表达量显著下调(P<0.05)。见表4。

表1 各组炎性细胞因子表达水平结果比较

注：与空白组比较，**P<0.01；与RA模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

表2 各组大鼠关节炎指数比较

注：与RA模型组比较，#P<0.05

表3 各组大鼠足体积比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与RA模型组比较，#P<0.05

表4 各组TLR4、NF-κB、p-NF-κB免疫组织化学检测结果(平均A值)比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与RA模型组比较，#P<0.05

2.4各组TLR4 mRNA 检测结果比较 与空白对照组比较，RA模型组TLR4 mRNA表达量升高(0.62±0.02vs. 1.00±0.00，P<0.05)；与RA模型组比较，阳性药双氯芬酸组(0.68±0.01)和雷公藤内酯醇组(0.71±0.03)TLR4 mRNA表达量下调(P<0.05)。

3 讨 论

雷公藤内酯醇是雷公藤的主要活性成分之一，是一个具有多种生物活性的天然产物，来源于中药雷公藤的根。近年来，国内外研究人员对雷公藤内酯醇做了大量研究，提示雷公藤内酯醇具有较为显著的抗炎作用，尤其是对RA有非常好的功效，能显著减轻骨关节疼痛、恢复关节功能、改善关节部位的组织液渗出性等[7-9]。本研究通过建立RA大鼠模型，对雷公藤内酯醇组的关节炎指数和足体积观察，与RA模型组比较，雷公藤内酯醇组在第8、12、16、20 天时关节炎指数和足体积降低(P<0.05)，表明雷公藤内酯醇可以显著改善RA的病症，对RA治疗作用显著，与其他研究结果相一致。

Toll样受体(TLRs)是Ⅰ类跨膜蛋白的受体家族，它能够识别病原相关分子，并介导固有免疫应答。而TLR4是第一个被发现的TLRs，外来刺激因子与TLR4受体绑定是激活固有免疫系统的第一步，经过一系列磷酸化的级联反应，使NF-κB定植于细胞核，启动一系列炎性介质的释放，其中包括TNF-α、IL-4、IL-6等促炎性细胞因子[10]。近来发现，TLRs在自身免疫性疾病，特别是RA的发病中有重要作用[11-12]。有研究发现，活动期RA患者外周血单个核细胞对TLR4的表达明显增加，并与RA严重程度的评分密切相关；在关节周围也存在一些可以被TLR4识别的病原体相关模式分子[13-15]。熊小泉等[16]通过对AIA大鼠外周血单个核细胞TLR4表达的研究，证明机体固有的先天性免疫系统参与了RA的病理过程。本研究结果也显示，在RA大鼠关节滑膜组织中，与空白对照组比较，RA模型组中TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达量和TLR4 mRNA表达量上调(P<0.05)，提示RA与TLR4/NF-κB信号通路的调控有关，表明TLR4及其介导的信号通路是RA发病过程中的重要环节。

NF-κB为普遍存在于细胞质中的转录因子，主要由p65和p50 2个亚单位结合成二聚体或异二聚体，其中P65为其主要功能亚单位，具有显著促炎活性。激活的TLR4可激发IKB激酶级联反应，激活NF-κB，从而启动与炎症免疫有关的细胞因子如TNF-α、IL-4、IL-6等基因的表达，最终产生大量TNF-α、IL-4、IL-6等炎性细胞因子。NF-κB能调节多种炎性基因的表达水平，与炎性反应的发生和发展密切相关[17]。国内外均有研究发现，NF-κB的表达与活性在RA中起重要作用，并且有研究表明，雷公藤内酯醇通过抑制NF-κB的活性和表达，在RA中发挥治疗作用[18-21]。那么，在RA中雷公藤内酯醇对NF-κB的上游信号通路TLR4/NF-κB调控如何呢？国内外文献尚未见报道。本研究结果显示，与RA模型组比较，雷公藤内酯醇组在RA大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表达水平呈极显著下降(P<0.01)，说明雷公藤内酯醇可以降低炎性反应对RA的损伤。并且与RA模型组比较，雷公藤内酯醇组RA大鼠关节滑膜组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达量和TLR4 mRNA表达量下调(P<0.05)，表明雷公藤内酯醇对TLR4/NF-κB信号通路有抑制作用，并可能由此减轻炎性细胞因子对RA的炎性反应。

4 结 论

本实验对RA大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表达水平及滑膜组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达进行了研究，结果表明，RA与TLR4/NF-κB信号通路的调控有关。雷公藤内酯醇可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的信号因子表达，从而减少炎性因子的产生，减轻炎性反应，起到治疗RA的作用，为治疗RA新药开发提供新途径。