长链非编码RNA-ROR在乳腺癌诊断中的潜在应用研究

曹鸣菲，雷德财，宋晓玉，吴立春△

(1.简阳市川空人民医院检验科，四川简阳 641400;2.四川省肿瘤医院检验科，四川成都 610041)

长链非编码RNA-ROR(lincRNA-ROR)首次是在多能干细胞诱导研究中发现的，是一个新的上皮-间质细胞转换诱导因子，能诱导乳腺上皮细胞产生干细胞样细胞并促进乳腺癌的转移，其表达水平与乳腺癌呈正相关[1-2]。本研究拟通过q-PCR方法，观察lincRNA-ROR在乳腺癌组织和外周血清中的表达差异，旨在为乳腺癌早期筛查、诊断治疗及预后判断提供实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究所有组织均来源于四川省肿瘤医院2017年1月至2018年12月行手术治疗患者术中切除的新鲜组织，收集其中配对的乳腺癌病理组织及其癌旁组织共计30对，样本均来源于简阳市川空人民医院术前临床诊断乳腺癌，术后病理确诊为乳腺癌患者，患者平均年龄(48.23±5.18)岁，并留取其手术前后1周的外周血液。与此同时，收集同期150例疑似乳腺癌病例，术中冰冻切片病理报告和术后石蜡切片病理确认为乳腺癌女性患者的有效新鲜血清，采血前均未进行任何临床治疗，其中早期乳腺癌患者50例，150例疑似乳腺癌患者平均年龄(47.84±6.34)岁。另选择体检健康者150例，平均年龄为(47.22±5.47)岁；乳腺良性疾病患者50例，患者平均年龄(48.12±5.83)岁。

1.2试剂与仪器 美国ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪器，日本岛津UV-2450紫外分光光度计，美国Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像仪，昕慧XH600电泳分析仪，罗氏Cobas e601电化学发光全自动免疫分析仪。PCR引物、焦碳酸二乙酯(EDPC，上海生工生物工程有限公司)，组织RNA提取试剂盒TRIZOl、PrimeScriptTMRTⅡ逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqⅡ扩增试剂盒(TaKaRa，大连宝生物工程有限公司)，外周血RNA提取试剂盒(Bioteke,北京百泰克生物技术有限公司)。

1.3方法

1.3.1样本处理 所有组织样本手术切除后置于经DEPC水处理的专用冻存管存放于-80 ℃冰箱备用；外周血液样本分离血清上机检测后保存备用。

1.3.2总RNA提取及cDNA的合成 严格按照试剂盒说明书进行操作，使用bioteke法和Trizol法分别提取外周血清中的总RNA，再采用大连宝生物试剂盒(PrimeScriptTMRTⅡ)逆转录合成cDNA。

1.3.3内参选择及引物设计 查阅相关文献[2]并设计引物，引物信息见表1。

1.3.4lincRNA-ROR表达水平的检测 q-PCR检测扩增后SYBR®Gree的荧光水平，并采用2-ΔΔCt计算分析样本中lincRNA-ROR的相对表达量，20 μL反应体系成分及用量见表2。

表2 20 μL反应体系成分及用量

1.3.5CEA和CA153水平检测 严格按照试剂盒说明书进行操作，运用罗氏Cobas e601电化学发光全自动免疫分析仪及其原装试剂检测外周血清中CEA和CA153的水平。

2 结 果

2.1总RNA提取及纯度鉴定 要求RNA吸光度(A)260/A280为1.8～2.0，电泳条带28S与18S亮度之比大概为2∶1，电泳图谱见图1。

图 RNA琼脂糖凝胶电泳图谱

2.2lincRNA-ROR在乳腺癌组织中的表达 熔解曲线呈单峰，扩增产物纯度佳，无二聚体形成，得到相应Ct值，通过2-ΔΔCt方法计算得出：30例乳腺癌组织中的lincRNA-ROR表达水平显著高于30例癌旁组织(2.46±0.99vs.0.83±0.37)，差异有统计学意义(t=10.78，P<0.000 1)。见图2。

2.3lincRNA-ROR在乳腺癌外周血清中的表达 lincRNA-ROR在150例乳腺癌患者外周血清中的表达水平明显高于150例体检健康者(1.76±0.70vs. 1.04±0.46)，差异有统计学意义(P<0.000 1)。见图3。

图2 lincRNA-ROR在乳腺癌组织中的表达

图3 lincRNA-ROR在外周血清中的表达

2.4lincRNA-ROR在乳腺良性疾病血清中的表达 lincRNA-ROR在50例乳腺良性疾病和50例体检健康者间的表达水平差异无统计学意义(1.24±0.45vs. 1.12±0.37，P>0.05)。

2.5lincRNA-ROR对乳腺癌的早期诊断价值 选取50例早期乳腺癌患者(乳腺肿瘤直径<3 cm，同侧腋窝无淋巴结转移，无远处转移)作为病例组，从150例体检健康者血清中选取50例作为对照组，并采用化学发光法检测CA153和CEA表达水平，对血清中的lincRNA-ROR、CA153和CEA绘制ROC曲线，结果显示，lincRNA-ROR的曲线下面积(AUC)为0.758，明显大于乳腺癌传统标志物CA153(AUC=0.663，P=0.011)和CEA(AUC=0.516，P=0.002)；lincRNA-ROR在乳腺癌诊断中的灵敏度和特异度分别为80.0%和73.3%，均高于CA153(灵敏度为73.3%，特异度为60.0%)和CEA(灵敏度为66.7%，特异度为50.0%)。通过对血清中的lincRNA-ROR、CA153以及CEA建立多元Logistic回归模型，发现3项指标联合分析后AUC为0.846，联合诊断效能优于3项指标单独使用。见图4。

图4 lincRNA-ROR对乳腺癌的早期诊断效能

2.6lincRNA-ROR与乳腺癌实体肿瘤的相关性 通过对30例乳腺癌患者手术前和手术后1周的外周血清中lincRNA-ROR的表达水平予以检测，检测结果表明，术后lincRNA-ROR的表达水平(0.90±0.35)明显低于术前(1.82±0.68)，差异有统计意义(t=6.58，P<0.001)。见图5。

图5 lincRNA-ROR与乳腺癌实体肿瘤的相关性

3 讨 论

肿瘤的侵袭转移是一个复杂的生物学进程[3-4]，传统乳腺肿瘤标志物缺乏足够的灵敏度和特异度，2007年美国临床肿瘤学会(ASCO)不再推荐其作为早期乳腺癌的诊断和术后随访观察指标[5]。新近研究显示，lincRNA-ROR 在胃癌[6]、肝癌[7]、食道癌[8]、胰腺癌[9]、结肠癌[10]、膀胱癌[11]、鼻咽癌[12]、乳腺癌[2]中发挥着致癌作用，而在神经胶质瘤中发挥抑癌作用[13-14]。HOU等[2]研究发现，lincRNA-ROR表达水平与乳腺癌呈正相关，当沉默lincRNA-ROR时则抑制乳腺肿瘤形成和转移，并通过miR-205/miR-145等实现对细胞分化、侵袭、转移、凋亡等癌症进程的调控。MA等[15]研究成果显示，lincRNA-ROR在三阴乳腺癌的组织和细胞系中高表达，同时lincRNA-ROR作为miR-145的内源性竞争性RNA上调MUC1基因的相对表达量来影响E钙蛋白的细胞膜定位，并通过lincRNA-ROR/miR-145信号通路促进三阴乳腺癌肿瘤细胞的侵袭和转移[16-17]。应用AUC评价试验诊断价值是现行公认的理想方法[18]，本研究通过绘制ROC曲线发现lincRNA-ROR相对于CEA和CA153具有更高的灵敏度和特异度，并且lincRNA-ROR、CEA和CA153联合检测效能得以显著提高(AUC=0.846)，这表明血清中的lincRNA-ROR可能为乳腺癌诊断的一个潜在分子标志物。

近年来大量临床药物研究表明，高表达lincRNA-ROR可促进波形蛋白、神经型钙黏蛋白的表达，抑制上皮黏蛋白的mRNA及其蛋白的表达，进而导致对5-氟尿嘧啶、紫杉醇、他莫昔芬、吉西他滨等药物耐受，是乳腺癌化疗、激素治疗泛耐药的一个分子标志物[19-21]。而体内外研究结果显示,葡萄素通过LincRNA-ROR/miR-145/ARF6信号通路使乳腺癌细胞转移相关蛋白Snail、波形蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9下调和上皮钙黏附素表达上调，进而发挥出抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的能力，为临床乳腺癌的治疗提供了新的思路和依据[22]。前期有研究发现，lincRNA-ROR与乳腺癌患者的年龄、TNM分期、HER2、Ki67、部位(左侧、右侧、双侧)无关[23]。后期也有研究证实，linc-ROR rs4801078位点的等位基因与血液中Linc-ROR水平密切相关[24-25]，linc-ROR rs4801078 TT (OR=1.791,95%CI:1.195～2.683)基因型可以增加乳腺癌的发病风险；Linc-ROR rs4801078、怀孕次数、绝经状态三者之间的交互作用亦可以增加患乳腺癌的风险[26]。

本研究进一步研究发现,lincRNA-ROR在乳腺癌患者术后显著降低，同时在乳腺纤维瘤、乳腺增生等乳腺良性疾病患者血清中无明显变化，这提示血清中lincRNA-ROR表达水平可动态反应乳腺癌患者体内肿瘤表达情况，通过对乳腺癌患者外周血清中lincRNA-ROR的表达水平监测，可以实现对乳腺癌患者手术效果评价和肿瘤复发的监控，进而更准确地预测乳腺癌治疗效果，为临床制订乳腺癌诊治策略的个体化及其预后随访的精准化提供强有力的指导。

4 结 论

LincRNA-ROR在乳腺癌患者组织和外周血液中表达上调，并具有良好的灵敏度和特异度，可作为乳腺癌早期筛查、诊断及预后判断的一个新型分子标志物和治疗的潜在靶标，但其在乳腺癌诊治的临床实用价值尚待进一步研究。