129株非结核分枝杆菌采用两种分子检测技术行菌种鉴定的结果分析

刘佳文 吕红艳 丁北川 张治国

非结核分枝杆菌(NTM)，也曾称为非典型分枝杆菌，是指除结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex， MTC)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。现有的文献提示我国分离最多的NTM菌种为胞内分枝杆菌，在北方可达40%～60%[1]。近年来，随认识的提高和检查手段的提高，出现一些不常见的NTM菌种。四川省自贡市在国内首次报道外来分枝杆菌和奥巴涅分枝杆菌[2]。为探讨NTM分子菌种鉴定方法临床检查的应用意义,本研究对129株 NTM 临床分离株的菌种鉴定结果进行分析。

资料和方法

一、一般资料

NTM临床分离株来源于2014年北京老年医院(23株)、北京结核病控制研究所中心实验室(69株)、北京市昌平区结核病防治所(37株)，共计129株。

二、试剂及方法

采用芯片杂交法(中国江苏猎阵生物科技有限公司)和16S rRNA基因测序法鉴定分枝杆菌(北京六合华大基因科技有限公司)，2种方法实验操作者之间采用双盲法。芯片杂交法严格按厂家说明书进行操作。16S rRNA基因测序法来自文献[3]。

(一)芯片杂交法鉴定分枝杆菌

1.主要仪器及试剂：分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(膜芯片法)(江苏猎阵生物科技有限公司)，ETC811基因扩增仪，多孔板恒温振荡仪(型号：MB100-4A)。

2.分枝杆菌分离株DNA的提取：(1)取相应数量的1.5 ml的提取管标记。(2)向每个提取管中加入200 μl的“解液A”。(3)用Tip头挑取少量培养的菌落，放到加了“解液A”的提取管中,盖上盖。(4)将提取管在超级恒温混匀仪中进行金属浴10 min(恒温混匀仪参数设置：振荡强度1600 r/min,温度95 ℃)。(5)金属浴后，12 800×g离心3 min,上清液即可作为扩增模板进行扩增。

3. PCR扩增：PCR扩增反应体系，17 μl扩增反应液，3 μl模板DNA，PCR扩增程序：50 ℃ 2 min；94 ℃ 4 min；采用94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s进行35个循环后；再进行94 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s，20个循环；保持4 ℃。完成扩增反应后，PCR产物可立即检测；如不立即检测则置于-18 ℃及以下保存，并在1周内完成检测。

4. 芯片杂交：(1)提前20 min打开恒温振荡仪，温度设置在45 ℃。(2)拿出对应样本数量的晶格，分别进行编号。(3) 每份样本应将600 μl 分枝杆菌菌种鉴定(MY)反应液1和待检样本的20 μl PCR扩增产物加入反应槽中。(4)将晶格转入恒温振荡仪，振荡强度1500 r/min，振动10 min。(5)反应结束后将晶格取出，开盖，将晶格略倾斜，吸净每个反应槽内的液体。(6)向每个反应槽内分别加入1 ml MY反应液1, 振荡强度1500 r/min，振动2 min。(7)反应结束后将晶格取出，开盖，将晶格略倾斜，吸净每个反应槽内的液体。(8)根据检测数量，先预混合反应液1和反应液2至15 ml准备管中，反应液1每人份用量为600 μl，反应液2每人份用量为1 μl。(9)向每个反应槽内分别加入600 μl MY反应液1和MY反应液2预混合液, 振荡强度1500 r/min，振动3 min。(10)反应结束后将晶格取出，开盖，将晶格略倾斜，吸净每个反应槽内的液体。(11)向每个反应槽内分别加入2 ml的MY 缓冲液，盖上盖，置于恒温振荡仪，振荡强度1500 r/min，2 min。(12)重复“(10)、(11)”一次。(13)开盖，将晶格略倾斜，彻底吸净每个反应槽内的液体。(14)向每个反应槽内加入500 μl的MY反应液3，保证充分浸没MY猎阵芯片，通过恒温振荡仪振荡，强度1500 r/min，反应3 min。(15)每个反应槽内加入自来水，轻轻晃动晶格5 s，终止反应。直接在水中观察每个MY猎阵芯片上的反应结果。DNA的提取、PCR扩增、芯片杂交及显色操作参照试剂盒说明书。

(二)16S rRNA基因测序鉴定分枝杆菌

1.分枝杆菌分离株DNA的提取：(1)取80 μl无菌水置于1.5 μl EP管中，挑取生长良好的菌落4～5个(尽量不要取到培养基)于管中。(2)于100 ℃水中煮20 min，然后立即置于冰上10 min。13 000×g离心2 min。(3)取上清于新的1.5 μl EP管中，以此作为PCR扩增的DNA模板，存于-20 ℃。

2. 试剂：2包TaKaRa的Taq酶(大连TaKaRa公司)；两对引物，上下游引物各2管，每管50 μl；6×载样缓冲液。

3.主要仪器：BIO-RAD My Cycler PCR扩增仪(美国伯乐公司)。

4.引物: 引物NT1.1F(GAGATACTCGAGTGGCGAAC)，NT1.1R(GGCCGGCTACCCGTC-GTC)可扩增所有分枝杆菌16S rDNA基因，产生212 bp的目的片段；引物NT-3F(CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG)，NT-3R(GCCCGTATCGCCCGCACGCT)扩增可得到500～700 bp的目的片段，扩增产物用于16S rRNA基因测序[3]。

5. PCR扩增：PCR扩增体系中，灭菌蒸馏水33.5 μl，TaKaRa Taq(5 U/μl)0.5 μl，10×PCR Buffer (Mg2+free) 5 μl，dNTP mixture(为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液)各2.5 mmol 4 μl，25 mmol MgCl23 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板2 μl。扩增条件：预变性94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 1 min，64 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，34个循环后，72 ℃延伸5 min，保持4 ℃。

6. 琼脂糖凝胶电泳：扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，M2000的DNA Marker 5 μl，PCR产物7 μl，6×载样缓冲液2 μl。

7. 16S rRNA基因测序：扩增产物送华大基因公司测序,送测序除PCR产物还送测序引物。测序引物既可送上游也可送下游引物。送“NT-3F”方向填 “正向”；送“NT-3R”方向填“反向”。测序样本送30 μl。

8. 序列比对：使用的是北京胸科医院国家结核病临床实验室开发的分枝杆菌菌种鉴定DNA序列比对系统，序列比对网址：http://111.207.168.134/NLC，以未知序列与标准序列比对结果中最高得分值的比对结果为判定对象，16S rDNA相似度≥99.0%，标准序列对应的细菌名称即为未知序列的细菌名称。

三、统计学处理

使用SPSS 17.0软件对NTM临床分离株不同菌种在3家机构中的分布数据进行统计、分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

已知7株结核分枝杆菌和1株瘰疬分枝杆菌作为质控株，随样本一起随机编号进行16S rRNA基因测序和芯片杂交法全程操作，2种方法中8株质控株检测结果与目标结果相符。

129株NTM临床分离菌株中，有107株进行分枝杆菌16S rRNA基因PCR扩增(NT1.1F，NT1.1R)阳性，并完成了16S rRNA基因测序(NT-3F，NT-3R)，其中59株为胞内分枝杆菌(55.1%)；29株为堪萨斯分枝杆菌(27.1%)；5株为龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌(4.7%)；3株为鸟分枝杆菌(2.8%)；2株为偶发分枝杆菌；2株为戈登分枝杆菌(1.9%)。129株NTM菌株中，有116株进行芯片杂交法鉴定分枝杆菌。结果见表1。

129株NTM菌株中，有96株同时进行芯片杂交法和16S rRNA基因测序鉴定分枝杆菌。2种方法的符合率为88.5%(85/96)，结果见表1。

表1 不同菌种分别在芯片杂交和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定时的结果分析

注表中“其他NTM”为母牛分枝杆菌、明尼苏达分枝杆菌、熊本分枝杆菌、提门分枝杆菌(M.temen)

11株NTM菌株采用芯片杂交法与16S rRNA基因测序的检测结果不相符(表2)。16S rRNA基因测序结果发现有3株外来菌株，分别为明尼苏达分枝杆菌、熊本分枝杆菌、提门分枝杆菌(M.temen)。

表2 芯片杂交法和16S rRNA基因测序检测结果

3家机构NTM临床分离株主要以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌为主。除龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌外(χ2=12.867，P<0.05),其他种类分枝杆菌在3家机构临床分离菌株中的构成比差异无统计学意义(表3)。

讨 论

北京老年医院为北京市海淀区结核病诊疗委托医院，每年患者标本中都能分离出NTM，但是由于条件限制，未及时准确地进行NTM菌种鉴定。没有实验室及时准确的NTM菌种鉴定，临床不能做及时准确的诊断，只能采用经验用药，疗效往往欠佳[4]。分离出来的NTM菌株是哪种NTM,是否是致病菌，该怎样用药，临床需要实验室的NTM数据来分析回答这些问题[1]。

用2种分子生物学方法进行NTM菌种鉴定，已有文献报道[5-8]；还有采用MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)结合DNA测序方法进行菌种鉴定的报道[9-10]。首先NTM鉴定需要快，本研究采用的芯片法全流程只需要4 h，也有报道需要6 h[5]。芯片法虽然鉴别能力较直接的基因序列分析弱，但简化了操作，并且具备鉴定临床常见NTM的能力，能够解决临床大部分问题[1]。本研究中96株同时进行芯片杂交法和16S rRNA基因测序法鉴定分枝杆菌，两种方法的符合率为88.5%(85/96)。用芯片杂交法解决了基因测序法88.5%的问题。关于芯片杂交法与16S rRNA基因测序法鉴定分枝杆菌的符合率有不同报道，有83.6%[11]、94.59%[6]和95.4%[5]等，大部分符合率相当高。这是选芯片杂交法用于初筛的理由。

表3 非结核分枝杆菌临床分离株不同菌种在3家机构中的分布

注表中“其他NTM”为母牛分枝杆菌、明尼苏达分枝杆菌、熊本分枝杆菌、提门分枝杆菌

其次，NTM鉴定需要准确，通过分析同源DNA序列组成差异可鉴定细菌至“种”的水平，是目前菌种鉴定的“金标准”[1]。因此，本研究在用芯片杂交法初筛后，选用16S rRNA基因测序法来确认。选用的16S rRNA基因鉴别能力虽然相对较低，但由于目前其相关数据库最为完整，是推荐常规使用的方法[1]。这样用两种方法进行NTM菌种鉴定得到的数据既有临床价值，也有流行病学科研意义[12]。

在分枝杆菌菌种鉴定过程中，质量控制至关重要[13]。用已知菌株来对测序和结果分析进行质量控制，以此来保证结果的准确性和可重复性。

本研究基因测序和芯片杂交两种方法实验操作者之间采用双盲，最后由1名工作人员来揭盲，将每个标本鉴定结果和标本来源单位一一对应。盲法最大限度地减少了个人主观判断对结果的影响[14]。

结果表明，3个单位的菌株，以肺部NTM 感染最常见的菌种(胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌)为主，超过80%。除龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌外,其他种类分枝杆菌在3家单位的构成比差异无统计学意义。说明在北京这3家机构分枝杆菌感染谱是相似的，可以合并来进行分析。合并3家菌株用测序进行分析，胞内分枝杆菌占55.1%，堪萨斯分枝杆菌占27.1%，龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌占4.7%，鸟分枝杆菌占2.8%，偶发分枝杆菌和戈登分枝杆菌均占1.9%,和苏州地区报道的结果相似[15]。云南以鸟分枝杆菌为主[16]。胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌用芯片杂交法和测序法之间的符合率为92.5%、92.3%、100.0%。芯片杂交法完全可以满足初筛的需求[6-7, 11]。

综上所述，先用芯片杂交法进行快速诊断，然后结合临床和测序法的结果确定诊断，如此的工作流程具有临床实用性。

张洁等[17]报道北京地区NTM菌种多达13种，可见新金色分枝杆菌及熊本分枝杆菌，本研究中北京结核病控制研究所中心实验室送来的菌株中基因测序鉴定出3株外来菌株，分别为明尼苏达分枝杆菌、熊本分枝杆菌、提门分枝杆菌。光产色菌“明尼苏达分枝杆菌”主要来自周围环境[18]；熊本分枝杆菌是不产色慢生长菌，可从有肺部感染的潜伏性结核感染者中分离到[17, 19]；提门分枝杆菌有报道能从HIV感染者身上分离到[20-21]。芯片杂交只能分析常见的15种菌，对这3种菌的鉴定都出现了错误。只有基因测序才能及时发现,有利于及时分析外来菌株和评估外来菌株的生物安全风险，以便及时采取措施应对外来菌种的侵害。

本研究中由于条件所限，如3家单位之间，以及单位内部存在的信息孤岛，临床信息缺乏，即使发现有意义的菌种如提门分枝杆菌，也没法进行深入的研究。因此，加强与临床的沟通与信息的互联互通，是接下来要做的工作。