IL-37对巨噬细胞吞噬杀伤结核杆菌能力的影响

陈思达 卓宋明 李 娜 吴雨梅 黄 震▲ 季乐财

1.深圳市龙岗中心医院呼吸内科，广东深圳 518116；2.深圳市龙岗区第三人民医院保安社区健康服务中心，广东深圳518115；3.深圳市慢性病防治中心，广东深圳 518020

结核病是由结核分枝杆菌感染引起常见慢性传染病，主要侵犯肺部，亦可通过血液、淋巴系统或创口直接接触等途径播散，可累及中枢神经、肠道、皮肤等[1]。巨噬细胞是机体抗结核免疫的重要效应细胞，其杀灭结核分支杆菌的途径主要有识别吞噬、自噬、分泌NO 等炎症因子等。同时巨噬细胞吞噬结核分支杆菌后，还可以作为抗原提呈细胞启动获得性免疫应答[2]。IL-37 是近年新发现的抑炎性细胞因子。现有研究发现，活动性肺结核患者血清IL-37 水平明显升高，并且可能诱导体内TH1/TH2细胞因子失衡，形成免疫抑制环境以允许结核分枝杆菌繁殖[3]。本研究通过siRNA 阻断巨噬细胞内源性IL-37 表达，及加入外源性IL-37 两种干预方式，评价IL-37 对巨噬细胞吞噬杀伤结核分枝杆菌能力的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及分组

THP-1 人单核细胞系购自中国微生物菌种资源库。分为四组，每组16 例：（1）对照组：加入非识别siRNA 作为空染对照；（2）灭活结核分支杆菌（iH37Rv）组：siRNA 空 染+iH37Rv 刺 激；（3）iH37Rv+siRNA 干扰组：siIL-37 转染抑制IL-37 表达+iH37Rv 刺激；（4）iH37Rv+IL-37 组：加入外源性IL-37+iH37Rv 刺激。

1.2 主要材料

RPMI 1640 细胞基础培养基购自Hyclone 公司，胎牛血清购自Gibco 公司，INTERFERin体外siRNA 转染试剂盒购自Polyplus 公司，逆转录试剂盒、实时定量PCR 试剂盒购自toyobo 公司，PCR 引物购自Invitrogen 公司，人IL-37 ELISA 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，H37Rv 结核标准株（ATCC93009）购自北京生物制品研究所，人IL-37干扰RNA 及其对照购自美国life technologies 公司，罗丹明B 购自美国Sigma 公司，NO 检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.3 细胞培养

THP-1 细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。培养基中加入青- 链霉素，放置37℃、5%细胞培养箱中培养。加入PMA（终浓度为50ng/mL）诱导分化为巨噬细胞。

1.4 siRNA转染

将装有siRNA 干粉的EP 管短暂离心，用无血清培养基将siRNA 稀释到22 mmol/L 作为siRNA 母液。取1μL上述siRNA母液，加入到191μL无血清的RPMI 160 培养基中，加入8μLINTERFERin试剂，室温孵育10min，让INTERFERin试剂和siRNA 形成转染复合物，细胞转染后孵育24h。

1.5 ELISA法检测培养上清中IL-37含量

用灭活的结核杆菌标准株H37Rv 按照细菌与细胞1 ∶10 的比例刺激THP-1 诱导生成的巨噬细胞，24h 之后ELISA 法检测上清中IL-37 含量。

1.6 RT-PCR检测细胞因子mRNA水平

使用Tizol 法提取总RNA，然后用逆转录试剂盒将RNA 逆转录合成cDNA，再根据RT-PCR 试剂盒说明书操作检测mRNA 水平。IL-37 内参引物如下：正义链5’-GCTCAGGTGGGCTCCTGGAA-3’，反义链5’-GCTGACCTCACTGGGGCTCA-3’。

1.7 Westernblot检测IL-37蛋白表达

吸除细胞培养上清，于4℃离心5min，收集沉淀细胞。RIPA 法裂解细胞，按照BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，调整为统一浓度，电泳按照80 ～90V 恒压，分离胶110 ～120V 恒压，到溴酚蓝到达分离胶最低端并且蛋白marker 条带清晰时停止电泳，转膜，脱脂奶粉室温封闭1h，先后加入一抗、二抗孵育，Millipore ECL 显色液显影，以IL-37蛋白与β-action 蛋白条带灰度值的比值作为相对表达量。

1.8 NO检测

1.9 罗丹明B标记分枝杆菌标准株H37Rv

称取0.7g 的罗丹明B 于研钵中研磨，溶于体积为100mL 的超纯水中，制成罗丹明B 溶液备用。H37v 65℃灭活2h，加入罗丹明B 溶液，混匀，37℃孵育30min；10μL 菌液涂片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察标记效率。

表1 各组巨噬细胞表达IL-37、IL-37mRNA及NO分泌量比较

表1 各组巨噬细胞表达IL-37、IL-37mRNA及NO分泌量比较

注：与iH37Rv 组比较，＊P ＜0.05

图2 巨噬细胞吞噬功能检测

1.10 巨噬细胞吞噬功能检测

以罗丹明B 标记的iH37Rv 和巨噬细胞按1：10 的比例孵育2h，移去培养液。再用RPMI-1640完全培养液洗去未黏附细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。加入0.04%中性红生理盐水溶液100μL/孔，继续培养30min，弃上清，用PBS 洗3 次，加入细胞裂解液200μL/孔，静置过夜，待细胞溶解后，使用流式细胞仪检测。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 iH37Rv刺激巨噬细胞分泌IL-37

使用ELISA 法检测iH37Rv 刺激巨噬细胞后IL-37 分泌量变化，iH37Rv 组与对照组比较，IL-37分泌量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。

2.2 IL-37 siRNA的有效性

iH37Rv+siIL-37 组 与iH37Rv 组 比 较，IL-37mRNA 表达下降，差异有统计学意义（P ＜0.05），见 表1。Westernblot 检 测IL-37 蛋 白 表 达 结 果与RT-PCR 结果一致。三组灰度值比值分别为（0.174±0.052）、（0.283±0.046）、（0.102±0.022）。与iH37Rv 组比较，iH37Rv+siIL-37 组IL-37 蛋白表达量下降，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图1。

图1 Westernblot 检测IL-37 蛋白表达

2.3 IL-37对巨噬细胞NO分泌量的影响

对 照 组、iH37Rv 组、iH37Rv+siIL-37 组 及iH37Rv+IL-37 组NO 分泌量比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。其中，iH37Rv+siIL-37 组与iH37Rv 组比较，NO 分泌量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。iH37Rv+IL-37 组 与iH37Rv 组 比较，NO 分泌量下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

2.4 IL-37对巨噬细胞吞噬结核杆菌能力的影响

与iH37Rv 组比较，iH37Rv+siIL-37 组巨噬细胞吞噬能力升高，iH37Rv+IL-37 组巨噬细胞吞噬能力下降（P ＜0.05），提示IL-37 可抑制巨噬细胞吞噬能力。见图2。

3 讨论

结核病是我国最为常见的传染病之一，可侵犯肺部、骨关节、肠道等人体不同系统，因此被认为是一种全身感染性疾病。结核分支杆菌侵入人体后，机体主要通过形成肉芽肿的形式控制结核分支杆菌的繁殖和扩散。肉芽肿内的巨噬细胞是控制杀灭结核分支杆菌的主要效应细胞[4]，结核性肉肿的结局与巨噬细胞的功能类型密切相关[5]。巨噬细胞参与机体的天然免疫和获得性免疫，是机体抵御结核杆菌侵犯的第一道防线。巨噬细胞具有强大的吞噬能力，其吞噬结核分支杆菌后，可通过自噬、凋亡等方式杀灭胞内的结核分支杆菌，同时能够通过产生诱导性一氧化氮合酶（iNOS）催化精氨酸生成NO 从而杀伤结核分支杆菌。巨噬细胞吞噬结核分支杆菌后，还可以发挥抗原提呈细胞作用，通过释放细胞因子，调节T 淋巴细胞信号传导等，启动获得性免疫应答[6]。因此，巨噬细胞对结核分支杆菌的吞噬杀伤作用在机体抗结核免疫中起重要作用。

IL-37 是新发现的具有负性调节作用的抑炎性细胞因子。在外周血单核细胞、肿瘤细胞、胃肠道和呼吸道上皮细胞等均有广泛表达[7]，但表达量极小。在自身免疫性疾病中IL-37 则有异常表达。比如在红斑狼疮、克罗恩病、风湿性关节炎等免疫损伤性疾病中IL-37 明显升高，推测可能为一种负反馈的抑炎作用[8]。在感染性疾病中，IL-37 高表达则区分不同情况。一方面，IL-37 升高可抑制感染性休克及病毒性肝炎的自身损害，被视为一种保护机制[9]。另一方面，在活动性肺结核中，患者血清和单个核细胞的IL-37 表达升高，则可能是结核分支杆菌诱导的免疫抑制，从而容许结核分支杆菌生存和繁殖[10]。本实验使用iH37Rv 体外刺激巨噬细胞，检测到IL-37 高表达，与既往实验推测的结果相一致。

为了进一步评价IL-37 对巨噬细胞吞噬杀伤结核菌能力的影响，本实验通过逆转录siRNA 干扰IL-37 表达，结果发现，巨噬细胞对结核分支杆菌的吞噬杀伤能力增强；引入外源性IL-37 后，发现巨噬细胞吞噬杀伤能力减弱。目前已有的研究表明，巨噬细胞的吞噬杀伤能力与其极化表型有关。经典活化型巨噬细胞（M1）具有较强的吞噬杀伤能力，主要由Th1 型细胞信号如IFN-γ、TNF 及细菌脂多糖（LPS）等诱导分化而来，主要介导促炎反应，抑制胞内寄生菌生长。在M1 型占主导的结核肉芽肿中，结核菌显著减少。替代活化型巨噬细胞（M2）吞噬能力弱，主要由Th2 型细胞因子如IL-13、IL-4及免疫复合物等诱导产生，主要作用是介导抑炎反应，促进组织修复。在M2 型占主导的结核肉芽肿中，常处于持续性感染状态[11-12]。IL-37 本身为抑炎性细胞因子，目前已发现IL-37 能诱导IL-10、IL-4 等多种Th2 型抑炎性因子分泌，抑制IFN-γ、IL-12 等Th1 型促炎性因子[13]。还有研究表明IL-37 可在肝脏疾病中诱导巨噬细胞向替代活化型（M2）极化[14]。因此，在肺结核感染患者中，IL-37可能通过调节Th1/Th2 的交替平衡，诱导巨噬细胞向M2 极化，弱化其吞噬杀伤能力[15]。

综上所述，结核分支杆菌能够刺激巨噬细胞分泌IL-37，IL-37 可能通过诱导巨噬细胞向M2 型极化进而抑制其对结核杆菌的吞噬杀伤能力。干扰IL-37 表达可增强巨噬细胞的吞噬杀伤能力。未来IL-37 可能成为结核免疫治疗的有效靶点。