MCP-1中和抗体鞘内注射对骨癌痛吗啡耐受大鼠OX-42和炎症因子表达的作用

丰 磊 白芬芬 赵晓媛 刘献文 刘 磊▲

1.山东省聊城市人民医院麻醉科，山东聊城 252000；2.山东省枣庄职业学院，山东枣庄 277800

癌性疼痛非常剧烈，严重影响癌症患者的生存质量[1]，而大剂量长时间的应用阿片类药物镇痛极易造成耐受甚至痛觉过敏[2-3]，目前国内外关于阿片耐受的研究几乎都是基于单纯吗啡耐受动物模型，但此动物模型并不能完全相符合癌性疼痛的临床实际[4]。骨癌痛是临床最常见最顽固的癌痛类型，骨癌痛大鼠模型能够模拟临床的实际情况，是理想的研究癌性疼痛模型。临床实践中，吗啡是最常用的阿片类药物，所以对阿片类药物耐受研究的常以吗啡耐受为代表。OX-42 抗体CR3 补体（C3bi）受体反应，识别CD11b 和CD11c（整联蛋白αM和αX 链）之间共有的表位。该抗体沉淀三种分子量在100kDa 附近的多肽，并抑制补体介导的玫瑰花结产生和白细胞迁移。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是结合C-C 趋化因子受体2 型（CCR2）的趋化因子。MCP-1 参与炎症性疾病，动脉粥样硬化和癌症的发展。其拮抗剂正处于治疗这些疾病的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中[5-6]。抗MCP-1 抗血清可预防炎性痛觉过敏[7]。有研究表明神经病理性疼痛可能与吗啡耐受存在相似的分子生物学机制，可能都和痛觉敏感性增高有关[8]，小胶质细胞（OX-42）活化可能是吗啡耐受形成的原因[9-10]。炎性细胞因子在慢性痛的调控中发挥重要作用[11-12]。伤害性刺激可引起IL-1、IL-6 的增多，其增多的程度与疼痛程度密切相关[13]。神经元和胶质细胞上的TNF-α、IL-1 和IL-6 受体激活可提高神经兴奋性，从而导致中枢敏化并且提高痛觉敏感性[14]。然而，小胶质细胞（OX-42）的活化及其介导的炎症反应是否导致骨癌痛大鼠吗啡耐受仍未可知。这正是本实验要研究的问题。

1 材料与方法

1.1 一般资料

雌性成年SD 大鼠共72 只，随机分为6 组（n=12）：B 组（骨癌痛组）、BM 组（骨癌痛吗啡耐受组）、BM+Ab 组（骨癌痛吗啡耐受注射中和抗体组）、BM+IgG 组（骨癌痛吗啡耐受注射IgG 组）、B+Ab 组（骨癌痛注射中和抗体组）、B+IgG 组（骨癌痛注射IgG 组）。B 组大鼠胫骨髓腔注入5μL（ 2×107个细胞/mL）Walker 256 细胞，第9 天鞘内注射生理盐水4μL，2 次/d，连续9d；BM 组大鼠胫骨骨髓腔注入5μL（ 2×107个细胞/mL）Walker 256 细胞，第9 天开始每天鞘内给予20μg/kg 吗啡，2 次/d，连续9d；BM+Ab 组大鼠胫骨骨髓腔注入5μL（2×107个细胞/mL）Walker 256 细胞，第9 天开始鞘内注射20μg/kg 吗啡，2 次/d，连续9d，第15 天开始每天鞘内注射MCP-1 中和抗体10μg，连续3d；BM+IgG 组大鼠胫骨骨髓腔注入5μL （ 2×107个细胞/mL）Walker 256 细胞，第9 天开始鞘内注射20μg/kg 吗啡，2 次/d，连续9d，第15 天开始每天鞘内注射IgG 10μg，连续3d；B+Ab 组大鼠胫骨髓腔注入5μL（2×107个细胞/mL）Walker 256 细胞，第9 天开始每日鞘内注射NS 4μL，2 次/d，连续9d，第15 天开始每天鞘内注射MCP-1 中和抗体10μg，连续3d；B+IgG 组大鼠胫骨骨髓腔注入（2×107个细胞/mL）Walker 256 细胞5μL，第9 天开始每日鞘内注射NS 4μL，2 次/d，连续9d，第15天开始每天鞘内注射IgG 10μg，连续3d。

1.2 骨癌痛吗啡耐受（MTBP）大鼠模型

Walker 256 乳腺癌细胞（中国医学科学院北京，中国）。如前所述制备。简而言之，当腹水变得明显并稀释至2×107细胞/ mL 的密度时，从大鼠的腹水中收集细胞。通过腹膜内注射戊巴比妥钠（40mg / kg；Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA）将六组中的大鼠麻醉。接下来，通过将10μL 含有1×105Walker 256 细胞的Hank’s 平衡盐溶液（Sigma Aldrich）注射到大鼠的胫骨骨髓腔中来建立骨癌疼痛的动物模型。通过连续鞘内注射吗啡（20μg/ kg，一天两次； Sigma Aldrich），在细胞注射后第9 天和第18天之间也诱导吗啡耐受性，从而建立MTBP 大鼠模型。在第18 天，所有大鼠均被处死。

1.3 免疫组化

OX-42 抗体SC-7898 来自SantaCruz 公司，SP试剂盒（60582471，北京中杉生物技术有限公司）。将脊髓组织复温，置于20%蔗糖溶液中脱水，使用冰冻切片机冠状位切片，然后PBS 液清洗。使用3%H2O2处理5min，用PBS 液清洗，使用5%～10%正常山羊血清封闭，在室温下孵育30 分钟。倾去血清，然后滴加浓度为1 ∶400 的一抗， 4℃过夜。PBS 冲洗，滴加生物素标记二抗，于37℃环境下孵育10 ～30min。PBS 冲洗，滴加辣根酶标记的链霉卵白素，37℃孵育10 ～30min。使用PBS 液冲洗，使用DAB 显色剂显色。贴片，晾干，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干。

所有大鼠脊髓腰膨大切片时，每只大鼠取5 张切片，于倒置显微镜下使用奥林巴斯照相机照相，每张切片取5 个视野，然后用Image-Pro Plus4.5 软件对照片进行处理，并计算每个视野阳性细胞数目和积分光密度值，取其均值，然后取5 张切片的均值做为这只大鼠脊髓的阳性细胞数（NUM，number）和积分光密度值（IOD，integrated optical density）。

1.4 ELISA

TNF-α 试剂盒 （bsk00162，上海信裕生物科技有限公司）；IL-1 试剂盒 [JK-（a）-0006，上海晶抗生物工程有限公司]；IL-6 试剂盒 （QN-PS1726，上海乔羽生物科技有限公司）。

1.5 统计学方法

采用SPSS16.0 统计软件包进行统计学分析，所有计量资料均以的形式表示，所有组间比较都进行单因素方差分析，P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鞘内注射MCP-1中和抗体后各组大鼠脊髓OX-42表达的变化比较

与BM 组相比BM+Ab 组大鼠脊髓OX-42 表达明显减少（P ＜0.05）。见图1、表1。

2.2 鞘内注射MCP-1中和抗体后各组大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6表达的变化比较

与BM 组相比BM+Ab 组大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6 表达明显减少（P ＜0.05）。见表2。

3 讨论

图1 各组大鼠脊髓OX-42 表达情况

表1 各组大鼠脊髓OX-42表达情况比较

表1 各组大鼠脊髓OX-42表达情况比较

注：与BM 组大鼠相比，*P ＜0.05

表2 各组大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6表达情况比较）

表2 各组大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6表达情况比较）

注：与BM 组相比，*P ＜0.05

在骨癌早期肿瘤细胞在骨髓腔内生长，产生明显的骨质破坏，可能是骨癌引起疼痛的机制[16]。在中晚期，肿瘤细胞也可分泌蛋白溶解酶，对感觉纤维和交感纤维发生蛋白溶解作用从而导致神经病理性疼痛[17]。在骨癌痛大鼠的初级传入纤维的脊髓背角区域，脊髓背角深层神经元中c-fos 蛋白和强啡肽表达增加明显[18]。这说明外周敏化和中枢敏化是骨癌性疼痛形成的机制[19-20]，有研究证实TRPV1 在机械触诱发痛和热痛觉过敏中起着重要的作用[21]。肿瘤基质中的炎症因子参与了癌性疼痛的发生。炎症介质HMGB1 和IL-1β 都在脊髓背侧角的表达增加，并且鞘内注射HMGB1 中和抗体可以有效的减轻触诱发痛反应，并且使IL-1β 的表达明显减少。因此，骨肿瘤可能通过诱导HMGB1的表达来增加脊髓IL-lbeta 的产生从而调节脊髓疼痛反应[22]。研究表明，含有NR2B 的NMDA 受体增加可能在小鼠骨癌痛的产生和维持中发挥重要作用[23]。研究发现，鞘内注射Nav1.8 反义寡核苷酸能显著减改善骨癌痛大鼠的疼痛行为学表现，由此推断Nav1.8 钠通道可能参与了骨癌痛的维持[24]。也有研究证实LPA 作为一种磷脂信号传导分子通过外周C 神经纤维敏化来诱发骨癌痛[25]。董航等[26]的研究也发现鞘内给予p38β 反义寡核苷酸能缓解骨癌痛大鼠热痛敏和机械性痛敏，并改善疼痛行为学表现。Jin 等[27]报道了骨癌疼痛大鼠的小胶质细胞和脊髓背角中OX-42 和p-Akt 的表达水平升高。通过鞘内注射MCP-1 中和抗体或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂抑制高表达。用抑制剂处理后，机械异常性疼痛减轻。Zhao 等[28]观察到鞘内施用MCP-1中和抗体减少吗啡抗性并抑制长期施用吗啡引起的脊髓小胶质细胞刺激。因此，抑制MCP-1 可为吗啡耐受性管理提供新的治疗方法。Yao P 等[29]注意到抗神经生长因子的抗体减轻了骨癌疼痛大鼠的痛觉过敏，其作用与μ-阿片受体的增加有关。在Walker256 肿瘤模型中COX-2 抑制剂DFU 通过抑制肿瘤组织和循环系统中的MCP-1 的产生发挥消退肿瘤活性[30]。

在本研究中，发现鞘内给予MCP-1 中和抗体后骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓OX-42、TNF-α、IL-1、IL-6 表达水平显著降低。推断MCP-1/CCR2可能是通过活化小胶质细胞介导炎症反应从而在大鼠骨癌痛吗啡耐受中发挥作用。这也为解决临床实践癌痛治疗中的阿片耐受问题提供了新的可能靶点和理论依据。