十二指肠溃疡中幽门螺杆菌定植与菌群结构的关系

陈 霞, 夏晨梅, 戴再友, 李倩倩, 金玲肖, 林佩丽, 张忠臣, 钟海兵,颜海帆, 王国平, 戴 丽, 钟玉芬, 吴忠标

1.温岭市第一人民医院消化内科, 浙江 温岭 317500；2.温岭市第一人民医院肾内科, 浙江 温岭 317500；3.温岭市第一人民医院内镜中心, 浙江 温岭 317500；4.温岭市第一人民医院泌尿外科, 浙江 温岭 317500

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是引起十二指肠溃疡的重要因素[1]，并会引起胃内严重的并发症。一项研究表明，在日本，94%的胃溃疡患者和98%的十二指肠溃疡患者与H.pylori的感染有关[2]。此前的研究[3]已经发现菌群定植在胃和十二指肠不同溃疡类型间存在变化。Hp阳性的十二指肠溃疡菌群多样性明显高于胃窦溃疡，且螺杆菌属在十二指肠溃疡中并非唯一的优势菌属。

十二指肠溃疡是临床上常见的消化性疾病，通常发生在十二指肠球部。胃及十二指肠内微环境的组成也是近年来的研究热点，Stearns等[4]对4名健康人的口腔相关菌群，胃、十二指肠和结肠黏膜相关菌群，以及粪便相关菌群进行了 16S rRNA 基因高通量测序,分析了健康人十二指肠粘膜优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)等。但还没有学者对十二指肠黏膜由于感染Hp引起的溃疡及非Hp感染引起的溃疡菌群结构的差异、Hp含量及其他菌群含量对溃疡形成的影响进行研究。

本研究针对十二指肠溃疡Hp阳性患者及阴性患者的十二指肠黏膜菌群丰度、菌群结构、生物多样性等进行分析研究。比较Hp引起的溃疡及非Hp感染引起的溃疡菌群结构的差异，分析Hp定植对十二指肠黏膜菌群的影响，明确除Hp外的菌群是否对十二指肠粘膜有影响，以期为研究黏膜菌群与溃疡疾病的相关性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为 2017 年 11 月～2018 年 3 月就诊于温岭市第一人民医院十二指肠球部溃疡但无胃溃疡确诊患者。治疗阶段时，对患者进行健康教育，告知所患疾病的病因、临床表现及疾病的发展等，告诫患者遵从医嘱的重要性。每位研究对象在胃镜检查前进行13C 尿素呼气试验检查(13C 使用 75 mg 剂量)。其中十二指肠溃疡且Hp阳性5例定为 A 组，十二指肠溃疡且Hp阴性 5 例定为 B 组。该研究已通过温岭市第一人民医院伦理委员会审核。

病例入选标准：①年龄 30～55 岁，男女不限；②因不同程度十二指肠溃疡等就诊；③近 2 周内未使用抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂或 PPI 制剂。④未进行过Hp根除治疗。病例排除标准：①严重心、肝、肾功能损害者；②妊娠或哺乳期妇女；③有食管、胃肠手术史者；④患者不能正确表达自己的主诉，如精神病、严重神经官能症者；⑤患者同时服用非甾体抗炎药或酗酒；⑥对青霉素药物过敏者。

本研究共纳入 10 位十二指肠溃疡患者。经过13C 呼气试验及Hp分离培养筛选，十二指肠溃疡Hp阳性组 5 例，平均年龄为 38.6 岁，男女比例为 2∶3；十二指肠溃疡Hp阴性组 5 例，平均年龄为 47.6 岁，男女比例为 3∶2。两组患者间年龄及性别无统计学差异。

1.2 标本采集

经胃镜下确诊为十二指肠溃疡无胃溃疡的患者，采集胃窦小弯处黏膜及十二指肠球部溃疡周边 2～3 cm 的球部部位各一块。采集的粘膜组织标本、胃窦小弯黏膜标本置于Hp分离培养保存，十二指肠球部黏膜置于含 TE 缓冲液(500 μL)的样品管中。

1.3 Hp分离及鉴定

对用于Hp分离培养的标本进行研磨接种培养，三气培养96 h观察结果，阴性样本培养时间延至 11 d。根据菌落形态、生化反应(尿素酶、氧化酶、触酶)判定培养结果。

1.4 样本 DNA 的提取及质控

胃黏膜样品采用博迈德公司的DNA提取试剂盒提取总基因组 DNA，并测序，具体的操作严格按试剂盒说明书进行。用 DNA 纯化试剂盒纯化并用0.8%琼脂糖凝胶电泳定性检测和测定浓度后 -20℃ 保存。

1.5 16S rRNA 基因建库及测序

针对所有胃黏膜样品的 16S rRNA基因 V3-V4 区，选用上游引物5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC-WGCAG-3’ 和下游引物5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTA-CTAATCC-3’ 进行扩增。扩增体系为(20 μL)： HiFi Buffer(2×)10 μL，模板为10 ng。扩增条件：95℃，3 min； 95℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，25 个循环；72℃，5 min。PCR 产物测序前处理：磁珠纯化：取上步20 μL PCR反应产物加入16 μL磁珠(磁珠要提前30 min放入室温)，吹打混匀，室温放置 5 min；将离心管放在磁架上 1～2 min 待液体变清，吸弃上清，勿碰到磁珠；缓慢加入200 μL 80%乙醇，洗涤，30 s后吸弃乙醇，重复一次；室温放置数分钟，挥发乙醇；待磁珠中心干裂即可加入 40 μL 水进行洗脱，用移液器吹打混匀，室温静置 5 min；将离心管放在磁架上 1～2 min 待液体变清，吸取上清至新的洁净离心管中，得到纯化后的一次PCR产物；最后，将总PCR产物经 Illumina MiSeq 测序仪进行测序。

1.6 测序数据分析

通过 CASAVA v1.8.2软件分析测序结果的原始图像数据，并在初步质量分析后获得测序数据。用 Pandaseq v2.7比较每两个序列并根据重叠区域的末端进行组装。使用 Trimmomatic v0.30去除引物和接头序列，以及两端质量小于 20 的碱基和长度小于 400 bp的序列。使用 Usearchv 8.0将剩余序列与数据库中的序列进行比较，并移除嵌合序列以获得最终验证的数据。操作分类单元(OTU)是聚类序列最小单元，通过 UCLUST 方法进行聚类，参数相似度设置为 97%，并获得OTU列表和OTU代表序列。根据OTU聚类的结果， ACE、 Chao1、Shannon和 Simpson 用于分析粘膜样品的丰度和多样性。使用 QIIME v1.7平台，基于 UniFrac 距离进行主成分分析。使用 UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚类方法，基于 weighted unifrac 和unweighted unifrac 距离矩阵，将样品进行聚类。得到 weighted unifrac 样本聚类树。

1.7 统计学分析

采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，均数比较采用t检验，通过 Kruskal-Wallis 检验比较每个门或属的中位数丰度，百分率的比较采用卡方检验，以P<0.05 判断差异是否有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 α多样性分析

本次测序共得到 760 312 条 Reads，有效 Reads 数为 730 818 条，所有序列按 97%相似度进行 OTU 分类，共得到 25 624 个 OTU。其中A组有 18 782 个OTU，B 组有 13 969 个 OTU，文本覆盖率为 96 %。计算 ACE、Chao1 物种丰度指数及 Shannon、Simpson 多样性指数。两组指数分析统计如图 1 。

结果发现，由图1A、B可知， A组ACE指数均值为10 750.3， B 组为7 284.4，A 组 Chao1 指数均值为 10 222.5， B组为 6 950.8，两组之间 ACE 指数和 Chao1指数差异均具有统计学意义(P<0.05)。说明Hp感染后反而增加了十二指肠溃疡黏膜中定植细菌的物种总数。而由图1C、D 可知， A 组 Shannon 指数均值为 8.6， B组Shannon指数均值为 7.1，A组 Simpson 指数均值为 0.98， B组 Simpson 指数均值为 0.95，两组之间 Shannon 指数和 Simpson 指数差异均不具有统计学意义(P>0.05)。统计显示， A 组菌群多样性均数比 B 组略高，但差异不具有统计学意义。

图1 α多样性比较Fig.1 Comparison of α diversity.注：A: ACE指数; B: Chao1指数; C: Shannon指数; D:Simpson指数。*表示在P<0.05水平上差异显著。

2.2 β多样性分析

采用 QIIME，计算得到 UniFrac 距离, 并经过 QIIME 对 UniFrac 距离进行主成分分析 (principal coordinate analysis)，得到物种的 weighted 的 UniFrac 聚类结果，得到 PCoA 分析图，如图2。

图2 PCoA分析图Fig.2 PCoA analysis diagram.A：PC1与PC2 为第一和第二主坐标得到的 PCoA 图；B：PC1与PC3 为第一和第三主坐标得到的 PCoA 图；C：PC2与PC3 为第二和第三主坐标得到的 PCoA图。

使用 UPGMA聚类方法，基于 weighted unifrac 和 unweighted unifrac 距离矩阵，将样品进行聚类。得到 weighted unifrac 样本聚类树，如图3。

图3 Weighted unifrac 样本聚类树Fig.3 Weighted unifrac sample clustering tree.

从图2可以看出，两组间的相似性较大，基本是聚类在一起的，但从图3可以看出，进化谱系中 A 组样本中有较显著的微生物群落差异。而 B 组样本中微生物群落差异很小。说明Hp的定植在一定程度上改变了原有的微生物群落。

2.3 菌群种系分布

每个样本在门水平下主要的物种分布柱状图如图4A，在属水平下主要的物种分布柱状图如图4B,从门水平上看，两组的优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)。

经过非参数检验分析，A组中厚壁菌门(Firmicutes)及Candidate_division_TM7 占的比例显著比B组大(P<0.05)(图5A、B)。

从属水平上看，优势菌属种类上 A 组与 B 组相差不多。共同的优势菌属为普雷沃氏菌属(Prevotella)、奈瑟菌属(Neisseria)和链球菌属(Streptococcus)等。在 A 组中可以发现Hp含量不高，有些样品Hp含量甚至少于10%。说明Hp可在十二指肠黏膜中定植，但不是唯一的优势菌群。

经过非参数检验分析， A 组中纤毛菌属(Leptotrichia)占的比例显著比 B组大(P<0.05)(图5C)。

图4 菌群种系分类分布图Fig.4 Classification map of flora germline.A：两组十二指肠黏膜菌群主要种系门水平分布图；B：两组十二指肠黏膜菌群主要种系属水平分布图。

图5 两组具有差异的种系比较Fig.5 Comparison of the two groups with different phylogeny.A：厚壁菌门含量的比较；B：Candidate_division_TM7 菌门含量的比较；C：纤毛菌属含量的比较。*表示在P<0.05水平上差异显著。

3 讨论

十二指肠溃疡的致病机理有很多，其中Hp感染是主要因素[2]。Hp是 1983年澳大利亚学者 Marshall 和 Warren 首次分离发现的，人们认为它定植在人胃黏膜内[5]。本研究发现，Hp也可定植在十二指肠黏膜内。但Hp在十二指肠黏膜内并不是绝对的优势菌群，与此前的研究结果一致[3]。

Maldonadocontreras等[6]研究表明Hp定植只能解释胃微生物群 28%的菌群变化，而 44%与宿主因素有关。宋阳等[7]通过蒙古沙鼠为实验动物建立定植模型发现Hp的定植会引起胃内菌群结构的改变。菌群的种类和数量上都会受到Hp定植的影响。胃内主要菌种的主导地位不会受到影响。在十二指肠黏膜中，菌群的物种数量上也受到Hp定植的影响。从 α 多样性角度看， A 组 ACE 指数及 Chao1 指数均值均比 B 组高，两组之间差异均具有统计学意义(P<0.05)。说明Hp感染后增加了十二指肠溃疡黏膜中定植细菌的物种总数。从 β 多样性分析来看， PCoA 分析图结果显示， A 组和 B 组样本参杂在一起，没有明显的分组聚类情况，说明十二指肠溃疡菌群结构比较相似。但进化谱系中 A 组样本中有较显著的微生物群落差异。而 B 组样本中微生物群落差异很小。说明Hp的定植在一定程度上改变了原有的微生物群落。

十二指肠的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)，与 Stearns等[4]的研究结果一致。拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)是肠道菌群的主要组成部分[8]，说明十二指肠离肠道较为接近，因此会受肠道菌群的影响；且十二指肠球部pH较高，比较适宜其他菌群的生长。 A 组中厚壁菌门(Firmicutes)及 Candidate_division_TM7菌门占的比例显著比 B 组大(P<0.05)，且细菌的丰度 A 组也大于 B 组(P<0.05)。已有研究表明，Hp感染患者胃内厚壁菌门的含量低于Hp阴性的健康人群[6]。但在本研究中，Hp感染的十二指肠粘膜内的厚壁菌门(Firmicutes)却比非Hp感染引起的十二指肠溃疡粘膜中含量多，说明当发生Hp感染时，十二指肠粘膜环境与胃粘膜环境的菌群变化不一样。

Candidate_division_TM7菌门普遍存在于世界各地的各种环境中[9]，以及许多人体部位，包括皮肤[10]、远端食道[11]、肠道[12]和口腔[13]中。但很难评估这些生物在健康和疾病中的特性，因为这个细菌门未被纯培养出来，人们对它知之甚少。 Hong等[14]研究发现，使用 5 -氟尿嘧啶(5-Fu)诱导肠粘膜炎发生后会降低粪便和/或盲肠内容物中变形菌门(Proteobacteria)、Tenericutes、Cyanobacteria 和 Candidate_division_TM7的比例。本研究中，在Hp感染的粘膜中 Candidate_division_TM7的比例较高，在非Hp感染引起的十二指肠溃疡粘膜中含量较少，说明微生物积极参与了溃疡形成的过程。Hp感染并定植在十二指肠黏膜之后，破坏了黏膜，其他细菌在Hp的协同作用下更容易入侵黏膜，从而导致Hp感染的十二指肠黏膜细菌数量比无Hp感染的十二指肠黏膜细菌物种数量多。

通过属水平的优势菌群可以看出，十二指肠溃疡的黏膜中普雷沃氏菌属占的比例很高，而普雷沃氏菌属在动物肠道里通常是优势菌群[15]，进一步说明十二指肠黏膜的菌群受肠道菌群的影响。两组患者都患有十二指肠溃疡，两组共同的优势菌属为普雷沃氏菌属(Prevotella)和奈瑟菌属(Neisseria)。普雷沃氏菌属(Prevotella)是近年来从类杆菌属中分出的一个新菌属，包括 20 种，是临床上较常见的一种条件致病菌[16]，而奈瑟菌属中也存在致病菌。说明造成十二指肠溃疡的原因除了Hp感染外可能存在其他的细菌感染。

同时， A 组中纤毛菌属(Leptotrichia)占的比例显著大于B组(P<0.05)。纤毛菌属(Leptotrichia)通常在口腔和泌尿生殖道中定殖[17]。传统观念认为其不致病，但近些年的报道显示纤毛菌属(Leptotrichia)也是一种条件致病菌，与感染相关[18]。纤毛菌属(Leptotrichia)的细胞表面有适合黏附的突出结构，当粘膜屏障破裂时，经常通过该屏障扩散到血流中[17]。在阴性溃疡患者及健康人[4]中，纤毛菌属(Leptotrichia)在十二指肠粘膜中含量较低，而在Hp定植的情况下，纤毛菌属含量增高，推测可能与Hp一起参与了溃疡的形成。

本研究还存在一定的不足之处，样本量较小，且十二指肠溃疡黏膜中的未知菌属还不能确定。因此需要通过宏基因组测序等方法来鉴定。截至目前，采用基于宏基因组学策略的高通量测序技术开展十二指肠黏膜菌群的报道还比较少，本研究希望能为以后的研究奠定一定的基础。

在存在溃疡的十二指肠黏膜中，Hp感染增加了黏膜内的其他物种细菌的定植，且幽门螺杆菌(Hp)不是唯一优势菌群。同时，Hp的定植对十二指肠粘膜菌群结构有一定的影响，十二指肠粘膜环境与胃黏膜环境对Hp感染发生时菌群变化不一样。造成十二指肠溃疡的原因除了Hp感染外可能存在其他细菌的感染。纤毛菌属(Leptotrichia)可能与Hp一起参与溃疡的形成。