基因检测指导中晚期宫颈癌个体化治疗的临床应用

雍家慧，陈象逊，罗薇薇，杨明威，钱雯川，张冬娟，吕 银，杨 林

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，严重危害女性健康[1]。联合放化疗是中晚期宫颈癌的标准治疗手段[2]。以顺铂为基础的同步放化疗方案使宫颈癌患者的生存获益显著增加，但30%～40%患者未能达到对同步放化疗的完全反应[3]，同时铂类耐药是导致患者预后不佳的重要因素。患者基因构成的差异是患者对化疗效果差异的原因之一[4]。大量研究表明，MDR1(G26677T/A)基因存在G2677T/A多态性，它与紫杉醇的疗效相关，2677GG基因型患者的总生存期差于GA、GT、TT、TA基因型患者；GSTP1(Ile105Val A/G)基因密码子105A>G 变异使GST 对化疗药物的解毒能力下降，细胞内药物量增加，疗效较好；CDA(A79C)基因中的CDA79A/A或CDA79A/C型的晚期非小细胞肺癌患者在接受吉西他滨治疗后有明显生存获益，其总生存期与携带CDA79C/C患者相比显著延长(P<0.001)[5]；但MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)三者基因多态性与紫杉醇、顺铂、吉西他滨对应宫颈癌化疗敏感性的关系未见相关报道。本研究在此基础上，通过检测中晚期宫颈癌患者外周血中MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因的表达情况，选用结果敏感度高的药物作为实验组的化疗方案，从而更精准指导患者进行治疗，可增加治疗疗效，改善预后。

1 材料与方法

1.1 病例资料2015年10月～2018年3月共收集46例患者，临床分期为Ⅱb～Ⅳa期，心肺肾脏器功能正常，无其他恶性肿瘤病史，既往未行放化疗。入组标准：① 年龄为18～80岁；② 经病理证实、初治的中晚期(Ⅱb～Ⅳa)宫颈癌患者；③ 体力状况(performance status，PS)评分0～1分，能耐受放化疗，无严重合并症，心肺功能良好；④ 患者自愿参加并签署知情同意书。排除标准：① 既往有其他癌症病史；② 伴随其他恶性肿瘤。将患者随机分为实验组(n=23)与对照组(n=23)。实验组患者年龄35～72(52.9±9.5)岁；鳞癌21例，腺癌1例，腺鳞癌1例；根据国际妇产科联盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2000年的手术病理分期：Ⅱb期8例，Ⅲa期6例，Ⅲb期8例，Ⅳa期1例。对照组患者年龄44～68(53.1±6.7)岁；鳞癌22例，腺癌1例，腺鳞癌0例；Ⅱb期10例，Ⅲa期4例，Ⅲb期9例，Ⅳa期0例。两组患者年龄(P=0.152)、组织学分级(P=0.339)以及临床分期(P=0.294)等差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1标本采集及DNA提取 在每个化疗周期开始前，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集宫颈癌患者外周静脉血3 ml，根据上海生工公司基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，-20 ℃储存。

1.2.2设计及合成引物 在美国国家生物技术信息中心提供的基因及单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphism，SNP)公共数据库中，查询MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因全序列及3个SNP序列，设计引物，由上海生工公司合成引物，如表1所示。

表1 引物序列

1.2.3PCR反应 配制50 μl反应体系: 1 μl(浓度50 ng/μl)模板DNA，2 μl(浓度10 μmol/μl)上游引物，2 μl(浓度10 μmol/μl)下游引物，2×PCRMix 25 μl，超纯水20 μl；反应条件: 94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统检测聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)产物。纯化PCR产物、测序，测序结果用DNASTAR软件中的Seqman和SeqBuilder进行分析。

1.2.4化疗方法 实验组患者使用测序法对MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)多态性进行检测，根据检测结果指导化疗方案：对于MDR1(G26677T/A)检测结果为GG型者，药物敏感度较低，放弃选择紫杉醇化疗，而检测结果为TT、TA、GA、GT、AA型，药物敏感度高，选择紫杉醇化疗[6-7]；对于GSTP1(Ile105Val A/G)检测结果为AA型者，药物敏感度较低，放弃选择铂类化疗，而检测结果为AG、GG型，药物敏感度高，选择顺铂化疗[8]；对于CDA(A79C)检测结果为CC型者，药物敏感度较低，放弃选择吉西他滨化疗，而检测结果为AA、AC型，药物敏感度高，选择吉西他滨化疗[9-10]。MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)对应的紫杉醇、顺铂、吉西他滨敏感度三个均高，采用紫杉醇+顺铂化疗方案；MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)对应的紫杉醇、顺铂、吉西他滨敏感度三个均低，只采用放射治疗。对照组化疗方案[11]：给予紫杉醇+顺铂(TP)方案化疗(详细方案见表2)。21 d为1个化疗周期，连续完成6个周期。

1.2.5放疗方法 实验组及对照组均进行放射治疗，包括盆腔外照射及腔内照射。给予调强放射治疗(intensity modulated radiation therapy, IMRT)外照射，DT50 Gy/25 f，每周5次；一般在外照射剂量达到30 Gy/15 f时配合腔内放疗，剂量5～6 Gy/次，每周1次，总5～6次。腔内治疗当天不行外照射治疗。

1.3 初期疗程判定标准根据药物体内代谢试验研究表明，按照1.2.4化疗方案指导，通过对实验组患者抽取外周血检测对应基因型，来判定患者对应药物敏感性，决定化疗方案。6个疗程结束后对患者进行随访，观察两组近期疗效及化疗药物相关不良反应：① 疗效评价根据实体瘤疗效评价标准RECIST标准[11]：完全缓解(complete response，CR)、部分缓解(partial response，PR)、稳定(stable disease，SD)和进展(progressive disease，PD)。客观缓解率(objective response rate，ORR)=(CR+PR)/(CR+PR+SD+PD)×100%。疾病控制率(disease control rate，DCR)=(CR+PR+SD)/(CR+PR+SD+PD)×100%。② 不良反应评定标准：不良反应的评价是根据美国国家癌症研究所常见不良反应事件评价标准(CTCAE)4.0版，在每次治疗前进行不良反应的记录。

1.4 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行数据分析，组间比较选用χ2或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MDR1(G26677T/A)、CDA(A79C)、GSTP1(I105V)位点的基因型MDR1(G26677T/A)位点的基因型表现为GG、TT、TA、GA、GT、AA均见突变；CDA(A79C)位点基因型表现为CC、AA、AC，均见突变；GSTP1(I105V)位点的基因型表现为AA、AG、GG均见突变；本研究纳入MDR1(G26677T/A)、CDA(A79C)、GSTP1(I105V)3个基因，各个基因型测序代表见表1。对MDR1(G26677T/A)、CDA(A79C)、GSTP1(I105V)3个基因的SNP位点进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果显示3个多态性位点的基因型对应P均>0.05，说明该样本分布均符合Hardy-Weinberg平衡，从而验证该样本人群的基因型频率符合遗传平衡法则，具有稳定性。

2.2 46例宫颈癌患者的化疗方案通过测序法对实验组23例患者进行基因多态性检测，实验组编号C1-C23，而对照组统一选用紫杉醇联合顺铂化疗，对照组编号D1-D23，实验组相关化疗方案见表2所示。

表2 实验组化疗方案

续表2

编号基因位点基因型体外药物敏感性化疗方案C16MDR1(G26677T/A)GG紫杉醇↓顺铂+吉西他滨GSTP1 (Ile105Val A/G)AG顺铂↑CDA(A79C)AA吉西他滨↑C17MDR1(G26677T/A)GG紫杉醇↓吉西他滨GSTP1 (Ile105Val A/G)AA顺铂↓CDA(A79C)AA吉西他滨↑C18MDR1(G26677T/A)GT紫杉醇↑紫杉醇+吉西他滨GSTP1 (Ile105Val A/G)AA顺铂↓CDA(A79C)AA吉西他滨↑*C19MDR1(G26677T/A)TA紫杉醇↑*紫杉醇+顺铂GSTP1 (Ile105Val A/G)AG顺铂↑CDA(A79C)AC吉西他滨↑C20MDR1(G26677T/A)GT紫杉醇↑紫杉醇+吉西他滨GSTP1 (Ile105Val A/G)AA顺铂↓CDA(A79C)AC吉西他滨↑C21MDR1(G26677T/A)TA紫杉醇↑紫杉醇+吉西他滨GSTP1 (Ile105Val A/G)AA顺铂↓CDA(A79C)AA吉西他滨↑C22MDR1(G26677T/A)AG紫杉醇↑紫杉醇+吉西他滨GSTP1 (Ile105Val A/G)AA顺铂↓CDA(A79C)AA吉西他滨↑*C23MDR1(G26677T/A)GT紫杉醇↑*紫杉醇+顺铂GSTP1 (Ile105Val A/G)AG顺铂↑CDA(A79C)AC吉西他滨↑

↑：表示基因检测化疗药物敏感性高；↓：表示基因检测化疗药物敏感性低；*：表示三种化疗药物敏感性都高选择紫杉醇+顺铂进行化疗

2.3MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)SNP位点的基因型在宫颈癌中的分布MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)SNP位点的基因型在宫颈癌中分布情况见表3。MDR1(G2677T/A)的TT、TA、GG、GA、GT基因型频率分别为4.35%、13.04%、17.39%、8.70%、56.52%，其中药物敏感组内TT、TA、GA、GT基因型频率分别为4.35%、13.04%、8.70%、56.52%，不敏感组内GG基因型频率分别为17.39%；GSTP1(Ile105Val A/G)的AA、AG基因型频率分别为69.57%、30.43%，其中药物敏感组内AG基因型频率为34.78%，不敏感组AA基因型频率为65.22%；CDA(A79C)的AA、AC、CC基因型频率分别为69.57%、26.09%、4.35%，其中药物敏感组内AA、AC基因型频率分别为69.57%、26.09%，不敏感组CC基因型频率为4.35%。

2.4MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因多态性与宫颈癌患者化疗敏感性的关系从23例宫颈癌患者经基因检测后对紫杉醇敏感者19(82.61%)例，不敏感者4(17.39%)例。其中MDR1(G2677T/A)多态的TT、TA、GG、GA、GT基因频率分布在化疗敏感组与化疗不敏感组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。23例宫颈癌患者经基因检测后对顺铂敏感者8(34.78%)例，不敏感者15(65.22%)例。其中GSTP1(Ile105Val A/G)多态的AA、AG基因频率分布在化疗敏感组与化疗不敏感组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。23例宫颈癌患者经基因检测后对吉西他滨敏感者22(95.65%)例，不敏感者1(4.35%)例。其中CDA(A79C)多态的AA、AC、CC基因频率分布在化疗敏感组与化疗不敏感组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)SNP位点的基因型在宫颈癌中的分布情况

表4 MDR1(G2677T/A)、GSTP1(I105V)、CDA(A79C)基因多态性与宫颈癌患者化疗敏感性关系

2.5 宫颈癌实验组与对照组近期疗效对比通过近期随访21 d为1个化疗周期，连续完成6个周期。将实验组和对照组疗效进行对比，发现实验组客观缓解率为95.65%，对照组客观缓解率为73.91%，实验组近期疗效明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5，而两组患者年龄、病理类型、临床分期比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表5 两组宫颈癌患者近期疗效比较[n(%)]

2.6 不良反应实验组发生Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制9例(39.13%)，Ⅲ度骨髓抑制12例(52.17%)，Ⅳ度骨髓抑制2例(8.69%)。23例发生Ⅰ～Ⅱ度胃肠道反应(100%)。20例发生0～Ⅰ度肝功能异常(86.95%)，3例(13.04%)发生Ⅱ～Ⅲ度肝功能异常。22例(95.65%)发生0～Ⅰ度肾功能异常，1例(4.34%)发生Ⅱ度肾功能异常。对照组发生Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制14例(60.86%)，Ⅲ度骨髓抑制7例(30.43%)，Ⅳ度骨髓抑制2例(8.69%)。22例(95.65%)发生Ⅰ～Ⅱ度胃肠道反应。22例(95.65%)发生0～Ⅰ度肝功能异常，1例(4.34%)发生Ⅱ～Ⅲ度肝功能异常。22例(95.65%)发生0～Ⅰ 度肾功能异常，1例(4.34%)发生Ⅱ 度肾功能异常。两组不良反应发生率相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高，且诊断时往往处于中晚期[1]。随着放疗技术的提高，单纯放疗对宫颈癌治疗疗效似乎达到一个瓶颈[6]。这可能与肿瘤体积较大，放射野与放射剂量的局限性有关。化疗可对放疗产生协同作用，增强放射敏感性，减少局部复发及远处转移的风险。目前单独或联合使用顺铂的同步放化疗方案是目前中晚期宫颈癌的标准治疗。但最佳治疗方法仍存在很多争议和不确定性[7]。与药物代谢、转运相关的遗传变异是导致个体间化疗反应差异的原因之一。在临床实践中进行相关基因检测，为个体患者提供基于基因型的药物和剂量处方，可使药物治疗变得更有效或更安全[8]。中晚期宫颈癌常见的化疗药物包括紫杉醇、吉西他滨、顺铂等。相关基因检测包括MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)。因紫杉醇联合顺铂是目前短期疗效最佳且毒副反应偏小的化疗方案[9]，故作为对照组化疗方案。

紫杉醇是ABC转运蛋白(也称为P-糖蛋白)的底物。P-糖蛋白通过主动泵出药物，使细胞内药物浓度减低，影响疗效。其表达和功能异常也被普遍认为是肿瘤细胞耐药的机制之一。P-糖蛋白由ACBC1(MDR1)基因编码，已报道MDR1基因有50多个单核苷酸多态性(SNPs)，其中G2677T/A SNP(rs2032582)可能与P-糖蛋白表达和功能有关。G2677T/A位点有三种单核苷酸多态性(SNP)：G/T/A。相关研究[10-11]发现G/G型可能为一保护性基因型，接受化疗的G/G(野生型)患者局控率和远期生存率均差于变异型。在本研究中，被检测为G/G型的患者不采用紫杉醇化疗。

谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是铂类药物的解毒途径之一。GSTP1位于5号外显子105位密码子A→G转换，导致异亮氨酸Ile替换为缬氨酸Val，可影响酶的活性。通过荟萃分析GSTP1多态性与铂类治疗疗效与毒性的关系，结果显示与A/A型患者相比，变异型患者有可能具有更好的有效率，但毒性更高。目前已证实GSTP1多态性可作为晚期NSCLC亚洲患者接受铂类治疗中的疗效、毒性、TTP和OS的预测指标[12]。在胃癌及结直肠的荟萃分析中亦显示GSTP1多态性与化疗反应率相关。在本研究中，被检测为A/A型的患者不采用顺铂化疗。

胞嘧啶核苷脱氨酶CDA可将绝大多数吉西他滨不可逆解毒为无活性代谢物双氟脱氧尿苷dFdU。CDA(A79C)核酸多态性可改变酶的活性，影响吉西他滨的有效浓度。Tibald et al[13]发现在接受吉西他滨化疗的患者中，携带A/A型和 A/C型的患者与C/C型患者相比具有更长的TTP和OS，差异具有统计学意义。故认为C/C型患者不能从吉西他滨化疗中受益。

本研究通过检测中晚期宫颈癌患者MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因的表达情况，选取敏感化疗方案进行适配化疗，近期疗效显示进行基因检测组疗效优于不进行基因检测组，预示基因检测可为中晚期宫颈癌患者的化疗方案进行指导，增加中晚期宫颈癌的局部控制率、减少远处转移的风险。但因研究样本量较少，随访时间较短。故仍需扩大样本量、扩大基因检测范围、延长随访时间进一步指导临床。