LETM1在胃癌中的表达及其与预后的相关性分析

陈乐乐，张开光，叶 超，陈 思，曹一凡，张云凤

中国是胃癌高发国家，近年来发病率和死亡率呈一定的上升趋势，严重威胁着人类的生存健康[1]。目前已知的生物标志物对胃癌患者的预后诊断价值都不太理想，因此寻找新型胃癌相关的生物标志物对胃癌的预后判断非常重要。LETM1作为一种线粒体内膜蛋白参与调节恶性肿瘤的进展，引起了国内外学者的广泛关注。目前研究已经证实LETM1与结肠癌[2]、食管癌[3]、膀胱癌[4]等多种肿瘤的发生密切相关，但其在胃癌组织中的表达水平及作用机制还尚不明确，因此，该研究的目的是通过检测LETM1在胃癌组织水平中的表达情况，分析其对诊断胃癌患者预后的预测价值，为胃癌的预后诊断提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集安徽省立医院2012年7月～2015年12月收治入院并行手术治疗的胃癌患者的临床病理资料，通过电话的方式进行随访，最终有114例胃癌患者纳入本次研究，患者术前均未行放化疗治疗。所有标本均来自于本院病理科标本库，由病理科医师重新阅片，收集其对应的胃癌组织蜡块。

1.2 受检组织LETM1的检测鼠抗LETM1单克隆抗体购于美国Abnova公司；免疫组化试剂盒、DAB显色剂购于上海Gene Tech公司。鼠抗人LETM1单克隆抗体按1 ∶300稀释，免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase，SP)进行处理，并严格按试剂盒说明书进行操作。最后由两名对临床病理信息不知情的病理科医师对免疫组化结果进行评估。按照阳性细胞所占百分比并参考着色强度进行分级, 无明显阳性细胞或染色较浅为(-)；阳性细胞数<25%, 颗粒棕黄色为(+)；阳性细胞数25%～50%, 颗粒棕黄色为(++)；阳性细胞数>50%, 颗粒深棕色为()。将LETM1染色(-)及(+)纳入低表达组，LETM1染色为()及()纳入高表达组。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行数据分析，组间比较选用χ2或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。利用Kaplan-Meier法进行生存分析，组间差异比较应用Log-Rank，通过多因素回归分析确定LETM1是否为影响胃癌患者的独立预后因素。

2 结果

2.1 患者一般情况114例胃癌患者中，男63例，女51例；手术时年龄≥60岁72例，<60岁42例。肿瘤>5 cm 46例，≤5 cm 68例。术后病理诊断证实：Ⅰ、Ⅱ期患者48例，Ⅲ、Ⅳ期患者66例。高、中分化53例，低分化61例。淋巴结转移阳性及阴性患者分别为56例和58例。

2.2 胃癌组织中LETM1的表达免疫组化结果显示，LETM1的表达定位在胃癌细胞线粒体内，阳性表达呈棕褐色，胃癌组织阳性表达率为59.65% (68/114)，癌旁正常组织为12.28% (14/114)，两者相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 LETM1在同一患者胃癌组织和癌旁正常组织中的表达情况 ×200A：LETM1在胃癌组织中的表达；B：LETM1在癌旁正常组织中的表达

2.3 LETM1表达与临床病理特征的关系LETM1与胃癌患者分化程度有关，低分化胃癌LETM1阳性表达率较高、中分化表达高，分别为71.70%和51.50%，差异有统计学意义(P<0.05)。LETM1与临床TNM分期有关,Ⅲ～Ⅳ期LETM1阳性表达率较Ⅰ、Ⅱ期高，分别为71.21%和43.75%，差异有统计学意义(P<0.01)，LETM1与是否发生淋巴结转移有关，淋巴结转移阳性的患者LETM1阳性表达率较无淋巴结转移者高，分别为69.64%和50.00%，差异有统计学意义(P<0.05) 。LETM1与患者的年龄、性别及肿瘤大小无关，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4 生存分析通过电话随访，最终有114例胃癌患者纳入本次研究，随访时间为5～64个月，中位随访时间为33个月。到随访时间截止，共有65例患者存活，49例死亡。统计结果发现114例患者中，LETM1蛋白高表达共68例，3年总体生存率为53.2%；LETM1低表达共46例，3年总体生存率为80.5%，上述两者指标比较，差异有统计学意义(χ2=6.097,P<0.05)。见图2。

图2 不同LETM1表达的生存曲线比较

表1 LETM1与胃癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

表2 胃癌术后预后的单因素Cox分析

表3 影响患者预后的多因素Cox分析

2.5 胃癌患者的预后因素分析单因素分析结果显示：LETM1蛋白表达水平、临床分期、分化程度，淋巴结转移及肿瘤大小是影响胃癌患者预后的相关因素(P<0.05)；性别、年龄对胃癌患者预后无明显影响(P>0.05)，见表2。

进一步COX多因素回归分析显示，LETM1表达是影响胃癌预后的独立影响因素，是否发生淋巴结转移、肿瘤分化程度及临床TNM分期亦是影响预后的独立影响因素(P<0.05)。LETM1表达高、临床分期晚、分化程度差、淋巴结转移阳性均可导致患者预后不良。见表3。

3 讨论

LETM1是一种极为保守的线粒体内膜蛋白，参与线粒体基本代谢反应的调节[4]，其改变可导致线粒体结构和功能明显受损，引发膜的通透性增加、活性氧过多释放及自噬作用的激活，导致细胞的破坏[5-7]。同时其作为线粒体内膜蛋白还参与调节肿瘤的进展，有文献报道LETM1可通过抑制线粒体的生成诱导 Hela细胞坏死，此外，还通过免疫组化法对多种肿瘤组织进行染色处理，发现LETM1在肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中呈高表达[8]，但其是否参与调控胃癌的进展目前还尚不明确。

本研究揭示了LETM1的表达水平与胃癌之间的关系，结果显示胃癌组织中LETM1呈现出棕褐色颗粒样深染，阳性表达强，而在癌旁正常组织仅呈浅色淡染，表达明显较低或几乎无表达。经比较分析胃癌组织及癌旁正常组织的阳性表达率分别为59.65% 和12.28%，说明LETM1在两者组织中存在差异性表达。但本次实验有少许切缘正常的癌旁正常组织也呈高表达，通过与其他癌旁组织的对比联合临床资料的分析，推测这些呈强染色的癌旁正常组织很可能在早期就出现转移现象，但由于术中快速病检的时间限制以及传统的生物标志物对一些细小的微转移而不易有效察觉。进一步的研究分析显示：与病理分化程度高、临床Ⅰ～Ⅱ期和淋巴结转移阴性的胃癌患者相比，病理分化程度低、临床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴结转移胃癌患者的LETM1阳性细胞数明显升高，这些结果表明LETM1在胃癌的发生发展中具有重要的作用。

Chen et al[9]研究发现LETM1阳性表达与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的临床分期及病理程度分级密切相关，临床分期越晚、病理分化越低时 LETM1表达阳性率越高，提示LETM1表达升高是HNSCC恶性程度增高、侵袭性增强、预后不良的表现。三阴性乳腺癌中LETM1过表达患者的10年总生存期和无病生存期均明显低于LETM1低表达的患者[10]。本次研究结果显示，LETM1高表达组的胃癌患者术后3年总体生存率明显低于低表达组，且LETM1高表达组中位生存期与低表达组相比明显缩短，说明LETM1高表达常提示术后预后不良，与在其他恶性肿瘤的研究结果高度一致，表明检测LETM1表达对判断胃癌预后也具有特定的参考意义。多因素回归分析提示LETM1表达上调可作为影响患者预后的独立危险因素，这进一步说明LETM1和胃癌预后之间存在一定的联系，对评估和判断胃癌患者的预后具有一定的指导意义。

LETM1可激活多种信号通路参与癌症的转移和浸润。肾癌细胞株中，抑制LETM1表达可引起β-连环蛋白、周期蛋白D1和c-Myc下调，进而导致细胞增殖、迁移和侵袭显著降低[11]。最近一项研究[12]显示LETM1与ESCC中Cyclin D1和pAkt的表达呈正相关，表明LETM1可能通过改变PI3K/Akt信号传导及细胞周期对肿瘤细胞进行调节。目前LETM1对胃癌细胞的调节机制尚不明确，仍需细胞功能实验予以验证。

本研究初步探讨了LETM1在胃癌中的表达，并通过对患者预后的随访研究得出了有意义的临床结果。然而本研究也有不足之处，一方面，由于临床资料有限，本次纳入研究的患者病理组织学类型均为腺癌，并未对其他少见类型的肿瘤分类纳入本次研究，所以研究结果并不能代表所有的胃癌组织类型。另一方面，受客观原因的限制，本研究仅采用免疫组化半定量的方法对114例胃癌患者的LETM1表达水平进行了评估，方法相对而言较为粗略，并不能完全代表LETM1的真实表达水平。但目前的初步研究结果仍支持进行进一步的细胞功能实验判断其对胃癌细胞生物行为的影响，从而更好的探究LETM1与胃癌的关系。

综上，LETM1蛋白在胃癌组织中的表达率较高，阳性表达常提示预后不良，可将其作为判断胃癌患者预后有价值的分子生物学指标。