Nemo样激酶基因多态性与结直肠癌遗传易感相关性

周轶凡，陈婷婷，程筱雯

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常见的癌症之一，大约35%的CRC风险可归因于遗传因素[1]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)构成了人类基因组90%以上的遗传变异，SNP可导致细胞异常分化进而促进肿瘤发展，在过去10年中，已发现超过60个SNP位点与CRC相关[2]。Nemo样激酶(Nemo like kinase，NLK)是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是丝裂原活化蛋白激酶[3]，有研究[4-5]表明NLK在多种肿瘤组织中表达异常，在肝癌和胆囊癌中高表达，而在肺癌、乳腺癌和卵巢癌中则低表达[6-8]。目前NLK与肿瘤的相关研究多集中在编码基因的细胞信号通路的研究，尚未见关于NLK的SNP位点与CRC关系的文献。此前有研究[9]在进行了1 000多例样本和近400个有丝分裂激酶SNP位点分析后仅筛选出1个SNP位点与浸润性上皮性卵巢癌的风险相关，即NLK基因的rs2125846。故该实验拟通过病例-对照研究分析该SNP位点在人群中的分布特点，探讨其与CRC发生风险的关系，为高危人群的CRC防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例资料本研究的所有受试者均来自安徽医科大学第一附属医院。病例对照研究中共纳入55例CRC病例和50例健康对照。所有病例均通过组织病理学诊断并排除术前进行放化疗或者合并糖尿病、肾病等自身免疫性疾病的患者。从健康体检者中随机选择与病例组年龄和性别相匹配的人群作为对照组。两组研究对象的一般资料比较差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学 将直径为3 μm厚的组织切片置于防脱载玻片，然后进行免疫组化。首先修复抗原，然后逐滴加入过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶，将该切片与多克隆抗NLK抗体在室温下以1 ∶200的稀释度温育，后滴加通用型二抗在室温孵育，最后进行显色反应。

1.2.2标本采集及DNA提取 采集病例组及健康对照的空腹静脉血。严格按照试剂盒(购自上海百傲公司)的说明书，从外周血白细胞中提取DNA，使用 NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪(美国Thermo公司)检测DNA含量，测量吸光度(absorbance, A)值A260和A280，比率均在1.8～2.0。

1.2.3SNP基因分型 该实验使用罗氏(美国Roche公司)高分辨率溶解曲线 (LightCycler ® 480， high resolution melting master，HRM )试剂盒进行实验，使用机器为Roche LightCycler96荧光定量PCR仪。PCR在96孔板中以20 μl的体积进行，包括40～60 ng DNA，5 mol/L的每种引物，1.6 μl MgCl2，6.2 μl水和10 μl 2×ResoLight Mix。 按照以下反应条件进行：95 ℃、10 min； 95 ℃、10 s，45个循环；58 ℃、15 s；72 ℃、15 s。 通过在65～98 ℃下以每1 ℃ 20次采集的速率获得HRM数据。

图1 CRC组织中NLK的表达情况 ×200

1.3 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行分析，使用χ2检验来比较病例组和对照组之间的基本情况。使用非条件Logistic回归模型分析不同遗传模型与CRC的关联，并计算优势比(adjusted odds ratio，OR)和95%置信区间(95%CI)。 AA表示野生纯合基因型，AG表示杂合突变基因型，GG表示纯合突变基因型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NLK在结直肠组织中的表达情况免疫组化实验结果显示，CRC组织中NLK的表达水平高于相应的癌旁组织。见图1。

2.2 NLK基因SNP位点rs2125846与CRC易感性的关联性rs2125846多态性型别为AA、AG、GG，在对照组中的分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=1.02，P>0.05)。病例组中AA、AG、GG的发生频率分别为41.8%、58.2%和0%；在对照组中，相应的数据分别为52.0%、36.0%和12.0%，差异有统计学意义(χ2=9.888，P=0.007 1)，即病例组与正常组之间NLK基因SNP位点rs2125846多态性分布不同。在共显性模型中，携带AG基因型患CRC的OR=2.01，95%CI：0.898～4.496，在10%的置信水平上显著，携带AG基因型的CRC发生风险是AA基因型的2.01倍。在隐性模型中，与AA基因型相比，携带G等位基因(GG+AG)的患者发生CRC的可能性是AA基因型的1.51倍(OR=1.51；95%CI：0.697～3.259)。见表1、2。

表1 NLK基因SNP位点rs2125846基因型分布

表2 病例组和对照组中NLK基因SNP位点rs2125846

2.3 NLK基因SNP位点rs2125846多态性与CRC发病风险关联的分层分析根据常见临床病理特征、患者年龄及CRC主要发生部位进一步对rs2125846多态性进行分层分析。在病例组中未检测到rs2125846多态性与病理特征、患者年龄及CRC主要发生部位有统计学相关性。见表3。

3 讨论

据全球癌症年报统计，2018年发生超过180万例新发CRC和CRC导致死亡881 000例，占癌症病例和死亡人数的1/10。总体而言，CRC的发病率排名第3，但死亡率排名第2。在最近10年中，中国的CRC死亡率和发病率均有所增加[10]。由于早期缺乏特异性和敏感性的分子标志物，许多临床患者在初步诊断时已被发现处于中晚期阶段[11]。SNP是一种常见的遗传变异，可导致不同的功能性产物而影响个体对疾病的易感性。因此，SNP可被视为预测包括CRC在内的散发性肿瘤风险的生物标志物。在过去的30年中，较多SNP通过广泛的全基因组关联研究和候选基因关联研究，确认与CRC风险相关联[12]。由于CRC发生发展的机制复杂，新的CRC相关遗传变异区域有必要进一步探索，以期寻求更有效的分子标志物和药物作用靶点。越来越多数据表明NLK被认为是潜在的肿瘤抑制因子或致癌基因，NLK的沉默或上调可以为肿瘤提供有效的治疗手段[13]。本研究中，免疫组化实验结果显示CRC组织中NLK的表达水平高于癌旁组织，该结果与之前的文献结果一致，NLK的过度表达与较差的临床病理参数相关，如晚期TNM分期、分化差、淋巴结和远处转移以及较高的CRC复发率[14]。NLK基因定位于人类染色体17p12，包含多个SNPs，其中 rs2125846位于NLK基因的第6个内含子内(2364A/G)，在2 364位点发生A—G的碱基替换。有研究[15]表明一些内含子多态变体具有赋予疾病易感性的潜力，由于内含子含有多种功能元件，包括内含子剪接增强子和沉默子，以及调节可变剪接的顺式作用RNA元件等，因此内含子区域的SNP对靶基因可能比迄今所认为的有更大的影响力。

表3 NLK基因SNP位点 rs2125846多态性与CRC常见临床病理学特征及年龄、肿瘤发生部位的关联分析

本研究NLK基因的SNP位点rs2125846中，病例组中AA、AG、GG的发生频率分别为41.8%、58.2%和0%；而在对照组中则相应为52.0%、36.0%和12.0%，病例组与正常组之间NLK-2364A/G基因型分布显著不同(χ2=9.888，P=0.007 1)。在共显性模型中，携带AG基因型患CRC的OR=2.01，95%CI：0.898～4.496，在10%的置信水平上显著，携带AG基因型的CRC发生风险是AA基因型的2.01倍。在隐性模型中，与AA基因型相比，携带G等位基因(GG+AG)的患者发生CRC的可能性是AA基因型的1.51倍。rs2125846多态性与CRC发病风险关联的分层分析中未检测到患者NLK-2364A/G与年龄、CRC主要发生部位及常见临床病理特征有统计学相关性，考虑其可能的原因有两个：一是因为样本量偏少，二是本次研究涉及的CRC相关风险因素及常见临床病理特征偏少。接下来的实验将扩大样本量同时纳入更多的CRC相关风险因素及常见临床病理特征进行更进一步的分析，目前SNP rs2125846作用的具体机制尚不清楚，故后续实验也将进行该位点的功能验证。

总之，本研究在中国人群中鉴定了位于人类NLK基因内含子内的与CRC风险相关的新易感位点rs2125846。随后需要进一步扩大样本量，扩大种族和地理覆盖范围及进行功能验证，以确认NLK基因对CRC发生风险的影响。