中华眼镜蛇膜毒素12对膀胱癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响*

（昆明医科大学第二附属医院 泌尿外科，云南 昆明 650101）

膀胱癌是全球第9大常见癌症，是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一[1]。根据2015年中国国家癌症登记中心的数据，膀胱癌发病率在男性癌症中位居第6，在中国的发病率及病死率呈上升趋势[2]。在对现有治疗手段进行规范和改进的同时，探究新的肿瘤治疗药物及靶点成为当今学界的研究热点。

眼镜蛇膜毒素12（membrane toxin 12,MT-12）是从中华眼镜蛇毒粗毒中提取出来的一种碱性膜活性多肽，主要是通过破坏细胞膜来发挥其毒性，故称为膜毒素[3]。根据毒性生物学效应不同，又可以命名为心脏毒素、细胞毒素。研究人员发现蛇毒对多种癌细胞均有明显的抑制作用[4-5]。蛇毒抗肿瘤机制尚未明确，目前研究认为其与对肿瘤细胞膜结构的破坏、干扰肿瘤细胞的DNA合成、诱导肿瘤细胞死亡等有关[6]。动物毒液诱发自噬能力的研究是毒素学领域的一个新兴趋势，文献中关于这一问题的研究较少[7]。故本实验探究MT-12对膀胱癌细胞株RT4和T24细胞增殖、凋亡的影响及与细胞自噬的关系，为进一步分析动物毒素MT-12与膀胱癌细胞自噬相关分子机制的研究提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

膀胱癌细胞株RT4细胞、T24细胞（昆明医科大学第二附属医院实验室），MT-12（分子质量约为6 700 kD，中国科学院昆明动物所动物毒素研究室），RPMI 1640培养基、二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（含EDTA）（美国Gibco公司），青霉素、链霉素、Western blotting配胶、电泳及转膜液试剂盒、V-ZAD-FMK和氯喹（上海碧云天生物技术有限公司），CCK-8试剂盒（上海东仁化学科技公司），Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），甲基噻唑基四唑（MTT）、LC3b一抗（美国 Sigma公司），Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥公司），内参抗体β-actin（北京博奥森生物技术有限公司），全自动凝胶图像分析系统（美国Bio-Rad公司），荧光倒置显微镜（日本Nikon公司），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养2株膀胱癌细胞 RT4 及 T24，于含10% FBS、1% 双抗的 RPMI 1640 培养基，5% 二氧化碳CO2培养箱中培养，实验细胞均处于对数生长期。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 取处于对数生长期的膀胱癌细胞，计数后调节细胞浓度为5×104个/ml，加入96孔培养板，每组设5个复孔，200 μl/孔，待细胞贴壁后丢弃原培养液再加入药物。实验组分别加入浓度为 0.10、0.25 和 0.50 μg/ml MT-12 的 RPMI 1640完全培养基 200μl；对照组加入 0.00 μg/ml MT-12的RPMI 1640完全培养基200 ml，无细胞的空白对照加入 200μl RPMI 1640 完全培养基。加药后细胞在37℃、5% CO2培养箱中分别孵育0、24、48、72、96及 120 h，然后加入 CCK-8 10 μl/孔，置 37℃、5%CO2培养箱2 h后，用酶标仪在490 nm处检测各孔的光密度（OD）值。每组实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡取处于对数生长期状态良好的膀胱癌细胞，常规消化、分离、收集细胞及细胞计数，接种于6孔板中，每组设3个复孔，培养24 h 后加药处理，实验组加入 0.50 μg/ml MT-12 的RPMI 1640 完全培养基，对照组加入 0.00 μg/ml MT-12的RPMI 1640完全培养基，同时设置NC溶媒对照组。消化收集MT-12处理6及24 h的膀胱癌细胞，离心弃上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。用 1×Annexin-binding Buffer液重悬细胞，调整细胞浓度为 1×106个 /ml，每份标本体积为 100 μl；5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl碘化丙啶染色溶液，室温下避光反应 10 min，加入 400 μl 1×Annexin-binding Buffer，在冰面上轻轻摇匀，上流式细胞仪进行检测分析。

1.2.4 细胞活性检测取处于对数生长期的膀胱癌细胞，计数后调节细胞浓度为5×104个/ml，细胞接种于96孔板培养贴壁12 h后加药处理：实验一组分组为（200 μl MT-12 0.50 μg/ml组、200 μl V-ZAD-FMK 50.00 μmol/L 组、100 μl MT-12 0.50 μg/ml组 +100 μl V-ZAD-FMK 50.00 μmol/L 组），对照组加入 200 μl RPMI 1640 完全培养基；实验二组（200 μl MT-12 1.00 μg/ml组、100 μl MT-12 1.00 μg/ml+100 μl氯喹5.00 μmol/L 组、100 μl MT-12 1.00 μg/ml+100 μl氯喹 10.00 μmol/L 组），对照加入 200μl RPMI 1640 完全培养基，设5个复孔，设置空白对照组。置37℃、5%CO2培养箱24 h，离心弃培养液，PBS清洗后，加入10 μl 5 mg/ml的 MTT 溶液培养 4 h，弃原培养基，加入DMSO 100 μl，用酶标仪在 490 nm处测定各孔的OD值。每组实验重复3次。

1.2.5 GFP-LC3转染实验 收集膀胱癌细胞，以 6×105个/孔接种于6孔板，孵育24 h后用无血清无双抗的RPMI 1640培养液进行培养；混合含GFP-LC3质粒和Lipofectamine 2000的培养液，室温孵育30 min后并缓慢倒入6孔板，培养箱孵育6 h，换含血清的RPMI 1640培养液。将对照组和MT-12（0.50 μg/ml）作用于经GFP-LC3转染后的膀胱癌细胞，且按1×105个/ml种植爬片，待细胞贴壁。细胞贴壁后用PBS洗涤细胞2次，4℃丙酮5 min固定后自然干燥。在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光斑点并拍照。

1.2.6 Westernblotting 检测蛋白表达情况 收集膀胱癌细胞，以6×105个/孔接种于6孔板，孵育24 h后，对照组和 MT-12（0.50 μg/ml）处理 24 h，用细胞裂解液RIPA充分提取蛋白并检测蛋白浓度，均衡每组蛋白浓度后，以12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，90 V条件下电泳，然后 100 V 4℃电转膜 2 h，5%脱脂奶粉封闭 1 h，TBST 漂洗，加入 LC3b 一抗（1：1 000），4℃过夜，TBST洗3次，再分别加入辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗（1：5 000）室温1 h，TBST洗3次，化学发光显色后胶片成像。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，多个时间点的比较采用重复测量设计的方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两个时间点的比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MT-12对膀胱癌细胞增殖的影响

不同浓度的MT-12处理后0、24、48、72、96和120 h的细胞OD值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的细胞OD值有差异（RT4：F =7 208.771，P =0.000 ；T24：F =4 778.191，P =0.000）；②实验组与对照组的细胞OD值有差异（RT4：F =264.599，P =0.000；T24：F =243.995，P =0.000），实验组较对照组细胞OD值降低，抑制作用增强，细胞生存率降低。③实验组与对照组的细胞OD值变化趋势有差异（RT4：F =173.869，P =0.000；T24：F =143.520，P =0.000）。不同浓度 MT-12 组处理后细胞OD值均呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），即时间因素和分组因素存在交互作用；不同浓度MT-12组在同一时间48 h前，细胞OD值无差异（P ＞0.05）；48 h后细胞 OD 值有差异（P＜0.05）。见图1和表1、2。

2.2 MT-12对膀胱癌细胞凋亡的影响

用 0.50 μg/ml MT-12 处理 RT4、T24 细胞 6 h 后，可观察到RT4、T24细胞凋亡的增加（见图2）。在6及24 h时，对照组与NC溶媒组凋亡率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。MT-12组细胞凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），24 h凋亡率较6 h大幅度增加（见表3）。MT-12能够诱导T24细胞的早期和晚期凋亡，而RT4则是主要发生早期凋亡（见图3）。

图1 不同浓度的MT-12对膀胱癌细胞增殖的影响（±s）

表1 不同浓度MT-12作用不同时间的膀胱癌RT4细胞增殖情况（±s）

表1 不同浓度MT-12作用不同时间的膀胱癌RT4细胞增殖情况（±s）

images/BZ_10_237_464_2243_535.pngimages/BZ_10_237_748_2243_819.png0.00 μg/ml 0.20±0.00 0.27±0.06 0.51±0.01 0.72±0.03 1.24±0.05 1.62±0.04 0.10 μg/ml 0.20±0.00 0.26±0.01 0.43±0.03 0.67±0.01 1.11±0.00 1.40±0.04 0.25 μg/ml 0.20±0.00 0.23±0.03 0.30±0.01 0.46±0.04 0.70±0.02 1.12±0.01

表2 不同浓度MT-12作用不同时间的膀胱癌T24细胞增殖情况（±s）

表2 不同浓度MT-12作用不同时间的膀胱癌T24细胞增殖情况（±s）

MT-12 浓度 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 0.00 μg/ml 0.20±0.00 0.26±0.01 0.42±0.03 0.60±0.02 0.83±0.02 1.33±0.03 0.10 μg/ml 0.20±0.00 0.26±0.01 0.39±0.01 0.51±0.02 0.72±0.02 1.17±0.06 0.25 μg/ml 0.20±0.00 0.25±0.01 0.28±0.03 0.47±0.03 0.58±0.02 0.90±0.02 0.50 μg/ml 0.20±0.00 0.23±0.01 0.26±0.02 0.32±0.02 0.48±0.02 0.53±0.03

2.3 V-ZAD-FMK和MT-12对膀胱癌细胞活性的影响

用 0.50 μg/ml MT-12 和 pan-Caspase 抑制剂 VZAD-FMK 50.00 μmol/L处理膀胱癌RT4和T24细胞后，各组的RT4、T24细胞活性率分别为：V-ZAD-FMK组（1.07±0.12）%、（1.09±0.12）%；MT-12组（0.59±0.03）%、（0.31±0.05）%；MT-12+V-ZAD-FMK 组（0.71±0.04）%、（0.55±0.06）%；各组RT4、T24细胞活性率比较，差异有统计学意义（RT4：F =49.505，P =0.000；T24：F =95.447，P =0.000）。RT4、T24细胞对照组与V-ZAD-FMK组间比较差异无统计学意义（t =1.427和 1.696，P =0.179和 0.116）；RT4、T24细胞对照组与MT-12组间比较差异有统计学意义（t =8.942 和 12.859， 均P =0.000）；RT4、T24 细 胞MT-12组与MT-12+V-ZAD-FMK组间比较差异有统计学意义（t =2.592和 4.452，P =0.024和 0.001）。见图4。

图2 0.50 μg/ml MT-12对膀胱癌细胞凋亡的影响（±s）

表3 各组RT4、T24细胞凋亡情况（%，±s）

表3 各组RT4、T24细胞凋亡情况（%，±s）

注：†与对照组比较，P＜0.05。

T24凋亡率 RT4凋亡率6 h 24 h 6 h 24 h对照组 0.46±0.23 0.55±0.34 4.89±0.25 5.35±0.12 NC溶媒组 0.22±0.12 0.35±0.12 4.84±0.02 5.86±0.23 MT-12组 9.22±0.31† 30.27±3.50† 20.63±1.54† 27.93±2.41†F值 1 449.344 215.448 306.230 254.634 P值 0.000 0.000 0.000 0.000组别

2.4 MT-12对膀胱癌细胞自噬的影响

GFP-LC3转染膀胱癌RT4和T24细胞后表达绿色荧光蛋白GFP，细胞无自噬时GFP-LC3广泛分布在细胞中。与对照组比较，MT-12处理的膀胱癌RT4和T24细胞在荧光显微镜下表现为绿色荧光点聚集现象。见图5。

图3 MT-12对膀胱癌T24、RT4细胞凋亡的影响

2.5 MT-12对膀胱癌细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达影响

图4 MT-12和Z-VAD-FMK对膀胱癌细胞凋亡的影响（±s）

在自噬过程中，LC3的胞质形式（LC3-Ⅰ）转化为磷脂酰乙醇胺结合形式（LC3-Ⅱ）。因此，LC3通常被用作监测自噬水平的分子标记。0.50 μg/ml MT-12处理膀胱癌细胞RT4和T24后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量分别为：对照组（0.05±0.00）和（0.79±0.04）；实验组（0.97±0.08）和（0.29±0.03）；实验组RT4和T24均较对照组差异有统计学意义（t =18.847和 16.154，均P =0.000）。见图6。

2.6 氯喹和MT-12对膀胱癌细胞活性的影响

用1.00 μg/ml MT-12和自噬抑制剂氯喹5.00和10.00 μmol/L处理膀胱癌细胞，各组的细胞活性率分别为（0.30±0.02）%、（0.45±0.05）%和（0.62±0.03）%，各组细胞活性率比较，差异有统计学意义（F =403.501，P =0.000）。两两比较发现，1.00 μg/ml MT-12+ 氯喹5.00 和 10.00 μmol/L 组相对单独 1.00 μg/ml MT-12处理组差异有统计学意义（t =7.056和15.174，均P =0.000）。见图7。

图5 GFP-LC3质粒转染膀胱癌RT4和T24细胞荧光图及斑点（荧光倒置显微镜×400）

图6 MT-12处理膀胱癌细胞RT4和T24后LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的表达（±s）

图7 氯喹和MT-12对膀胱癌细胞活性的影响（±s）

3 讨论

膀胱癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤，预估2018年，美国将有81 190例新病例和17 240例死亡病例[1]。临床上，膀胱癌被分类为非肌层浸润性膀胱癌和肌肉浸润性膀胱癌。目前，约有75%的病例初诊时局限于黏膜或黏膜下层，然而，大约50%～70%非肌层浸润性膀胱癌的患者有肿瘤复发，大约10%～30%的病例进展为肌肉浸润性膀胱癌[8]。故寻找更加有效的膀胱癌治疗药物，并充分了解其治疗机制成为临床治疗膀胱癌的热点。

自然产物是新型抗肿瘤药物的重要来源，许多物质均被证实有药用价值，对肿瘤的药物治疗有巨大贡献[5]。动物毒液是蛋白质和肽的混合物，主要的毒液成分通常包括神经毒素、真菌毒素、心脏毒素、苏木精及催化酶，毒液成分的药理活性作为潜在治疗剂的来源，一些动物毒素表现出深远的抗癌作用，影响癌细胞增殖、迁移、侵入、凋亡活性及新血管形成[5]。MT是眼镜蛇毒的主要毒性成分之一，既具有心脏毒性，又具有细胞毒性，尤其是对肿瘤细胞有毒性的组分，在蛇毒抗肿瘤作用的研究中占首要地位[9]。MT-12是从蛇毒中分离出的一种膜活性多肽，其毒性是通过破坏细胞膜结构而实现。相对分子质量为6 000 ～ 7 000 kD，对热稳定。MT-12 已被证明对多种体外肿瘤有选择性杀伤作用，对正常细胞的杀伤作用较小[3]；在体内能引起肿瘤体积缩小，延长荷瘤小鼠的存活时间，并抑制肿瘤的转移[4]。MT属于三指毒素家族，其4对高度保守的二硫键使得MT的空间结构呈三指状[10]。通过阻断烟碱和毒蕈碱性乙酰胆碱受体的活性，三指折叠毒素干扰与神经肌肉接头运作，为潜在特异性的治疗剂提供突破口[11]。

自噬是细胞体内平衡和适应环境改变的基本功能，如饥饿和细胞内蛋白质的清除和异常细胞器[12]。自噬对肿瘤发生、发展具有双刃剑的作用，在不同的条件和实验体系中存在差异。一方面能够通过降解细胞中非必需的蛋白质或器官，保持细胞内的代谢，为细胞提供必要的能量，维持细胞内平衡，从而促进肿瘤细胞对化疗和放疗的抵抗；另一方面，自噬还能够与细胞凋亡、细胞周期阻滞或相互作用，直接造成肿瘤细胞自噬性死亡，抑制癌症的发展[13]。

本实验首先检测不同浓度的MT-12对两种恶性程度不同的膀胱癌细胞RT4和T24的增殖影响。CCK-8 结果显示 0.10 μg/ml MT-12 对 2株细胞的生长增殖影响小，而0.25和0.50 μg/ml MT-12能抑制RT4和T24细胞的增殖。MT-12能够抑制膀胱癌RT4、T24细胞的增殖，且具有时间-剂量依赖性。随着时间的变化，MT-12能够促进RT4和T24细胞的凋亡。结果与增殖实验的结果趋势一致，MT-12作用于T24、RT4细胞后，细胞凋亡水平呈时间依赖性上升。

研究MT-12在抑制膀胱癌细胞增殖的分子机制时，发现采用Pan-Caspase抑制剂V-ZAD-FMK对2株膀胱癌细胞系进行处理后，MT-12并未完全失去对膀胱癌的抑制效果，暗示细胞死亡可能并不完全依赖于Caspase途径。自噬会大量降解胞内细胞器和大分子，诱导细胞死亡，有学者称其为Ⅱ型程序性死亡[14]，其特征是自噬体的出现，不依赖于Caspase途径。实验对可能的自噬性死亡做初步检测发现，通过MT-12作用于膀胱癌细胞株后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，GFP-LC3转染结果自噬体（绿色荧光点）增多。检测结果表明MT-12能够引起细胞的自噬。氯喹被认为是自噬抑制剂之一，为进一步明确MT-12与自噬关系，实验用氯喹和MT-12同时处理膀胱癌，结果发现氯喹能够消除MT-12对膀胱癌细胞增殖的抑制作用。这说明自噬性的死亡可能发生在MT-12对膀胱癌细胞的抑制作用过程中。

综上所述，MT-12对RT4和T24细胞增殖具有抑制作用，诱导细胞凋亡及自噬，其中具体分子机制及体外研究尚待进一步研究探讨。