雌激素对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期变化规律的影响

武开乐，库西塔别克·买买提依不拉音，马 静，邵 伟,，余 雄

(l.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052；2.新疆肉乳用草食动物营养重点试验室，乌鲁木齐830052)

0 引 言

【研究意义】雌激素(estrogen，E)在哺乳动物的生理过程中发挥着重要作用，其具有抗氧化、提高机体免疫力、促进机体生长发育等多种生理功能。【前人研究进展】大多数雌激素对于哺乳动物的研究，都主要集中在对猪和羊繁殖性能的影响[1]，以及雌激素对奶牛泌乳性能[2-3]、乳成分[4]、抗氧化[5]及免疫功能[6]的调节上，奶牛乳腺上皮细胞是雌激素在奶牛乳腺中的重要反应器，也是研究乳腺的生长发育和泌乳机制的重要体外模型。近年来，随着激素对乳腺上皮细胞功能影响的研究逐渐深入，对于雌激素作用乳腺上皮细胞的机制也逐渐的展开了研究。雌激素主要是通过与乳腺组织中雌激素的特异性受体(estrogenreceptor, ER)的结合，调节乳腺导管和乳腺腺泡的发育[7]，进而调节乳腺上皮细胞的生长发育。【本研究切入点】对奶牛乳腺上皮细胞的生长发育调控方面的研究却少之又少。研究雌激素对乳腺上皮细胞增殖及细胞生长周期变化规律的影响。【拟解决的关键问题】研究体外培养奶牛乳腺上皮细胞，分析不同浓度雌激素对其生长发育的影响，为雌激素在细胞分子水平上调控奶牛乳腺上皮细胞的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2017年11月至2018年1月,在新疆肉乳用草食动物营养实验室进行雌激素对乳腺上皮细胞的增殖及细胞生长周期规律影响的试验。

主要仪器为CO2恒温培养箱、洁净工作台、生物倒置显微镜、倒置荧光显微镜、离心机、酶标检测仪、流式细胞仪。

主要试剂为乳腺上皮细胞：购自中国科学院细胞库、MEBM、胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS)、核糖核酸酶RNase A、碘化丙啶 PI染液、胰酶Trypsin(Amresco)、PBS、CCK-8(Dojindo)。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将乳腺上皮细胞复苏后，添加细胞完全培养基，放入37℃、5% CO2培养箱培养后，选取扩增生长状态良好的乳腺上皮细胞，添加0、50、100、200 μmol/L雌激素孵育BMECs后，分别在0、12、24、48、72 h后采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各组细胞增殖情况，采用流式细胞术检测各组细胞周期情况。

试验分为两组：对照组为单纯乳腺上皮细胞培养组，试验组为不同浓度雌激素添加组。

1.2.2 细胞的复苏及纯化

将液氮罐中购买的细胞，用镊子取出，迅速放在已开启的37℃的水浴锅中，不停地在水中晃动，使其在1 min内融化。之后将其移至超净台内，用移液枪接种至25 cm2(T25)的细胞培养瓶中，加入完全培养基使其再次生长。在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达80%时开始进行扩增纯化。

1.2.3 细胞的培养

当细胞融合度达80%左右之后，将旧的培养基弃去，用2～3 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗两遍，加入预热好的0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化，在培养箱中孵育2～3 min，然后取出来在显微镜下一边观察一边轻微地弹下培养瓶底部，让其细胞脱落。在显微镜下观察到大约70%细胞脱落之后，加入完全培养基终止消化。再用移液枪进行轻微吹打将其余细胞吹打下来。移至离心管中，在2 000 r/min下离心2 min，小心弃去上清液，加入完全培养基并用移液枪打匀，传到细胞培养瓶中，正常情况下3 d可以长满培养瓶内部，在此期间可以换一次培养基。按照上述的培养方法，将细胞纯化扩增到第3代，在加入不同浓度的雌激素，然后将所有细胞样进行12、24、48和72 h的培养。

1.2.4 CCK-8细胞

(1)细胞种板：将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成细胞悬液，按3 000～5 000细胞每孔接种于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(5%)培养箱中37℃下培养过夜贴壁，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)按具体试验方案进行药物处理，每个样本浓度设3～5个重复。

(3)CCK-8反应：所有孔中分别加入10 μL CCK-8溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育2 h。

(4)测吸光度值：使用酶标仪测定450 nm光吸收值。

1.2.5 流式周期

(1)收集细胞：弃去上清，加入1 mL PBS清洗一次，弃上清，再加入1 mL 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1 500 /min离心5 min收集细胞。

(2)PBS洗涤细胞：加入3 mL 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。

(3)固定过夜：沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75%乙醇，重悬细胞，4℃过夜。

(4)PBS洗涤细胞：加入2 mL PBS混匀后，1 500 /min离心5 min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100 μL PBS重悬细胞。

(5)去除RNA：加入2 μL浓度为1 mg/mL的RNaseA(去离子水配制)，37℃水浴40 min。

(6)荧光标记：加入100 μL浓度为100 μg/mL 的PI染色液(PBS配制)，避光染色20 min。

(7)上机检测：流式细胞仪使用激发波长488 nm，发射波(长585±21 )nm进行检测，用Modfit 软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。

1.2.6 样品收集

收集对照组及各雌激素浓度添加试验组在0、12、24、48、72 h各时间点的细胞样品，每组设3个平行，3个重复，取样后将细胞样品先放置于-20℃的冰箱中2 h，后取出放置于-80℃的冰箱过夜，再将过夜后的细胞样品放入液氮罐中保存。试验结束后将样品送至北京华英生物技术有限公司检测细胞增殖及细胞生长周期。

1.3 数据处理

所有原始数据先用Excel 2016进行整理，用SPSS 22软件进行单因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较。数据最终计算资料用平均值±标准差(X ±S)表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准，P<0.01作为差异极显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 观察奶牛乳腺上皮细胞的形态

2.1.1 复苏后乳腺上皮细胞的形态

研究表明，复苏后经过传代纯化正常生长的奶牛乳腺上皮细胞分布均匀，细胞成片连接，呈鹅卵石样平铺瓶底。图1

图1 奶牛乳腺上皮细胞复苏后正常生长形态(200×)

Fig.1 Morphology of mammary epithelial cells in dairy cows after resuscitation(200×)

2.1.2 各试验组乳腺上皮细胞形态

倒置显微镜下观察到12 h时，50 μmol/L雌激素添加组的乳腺上皮细胞融合度最好(95%)，各试验组细胞成片连接，且呈鹅卵石样生长(图2)。24 h时，各试验组细胞体积变大，呈鹅卵石样均匀铺满瓶底(图3)。48 h时，各试验组细胞之间排列紧密，形成集落，聚集生长(图4)。72 h时，各试验组细胞细胞生长减缓，细胞数量减少(图5)。图3～5

A：0 μmol/L雌激素添加组；B：50 μmol/L雌激素添加组；C：100 μmol/L雌激素添加组；D：200 μmol/L雌激素添加组

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

图2 12 h时各试验组细胞生长形态(200×)

Fig.2 Growth morphology of cells in each experimental group at 12 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加组；B:50 μmol/L雌激素添加组；C:100 μmol/L雌激素添加组；D:200 μmol/L雌激素添加组

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

图3 24 h时各试验组细胞生长形态(200×)

Fig.3 Growth morphology of cells in each experimental group at 24 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加组；B:50 μmol/L雌激素添加组；C:100 μmol/L雌激素添加组；D:200 μmol/L雌激素添加组

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

图4 48 h时各试验组细胞生长形态(200×)

Fig.2 Growth morphology of cells in each experimental group at 48 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加组；B:50 μmol/L雌激素添加组；C:100 μmol/L雌激素添加组；D:200 μmol/L雌激素添加组

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

图 5 72 h时各试验组细胞生长形态(200×)

Fig.5 Growth morphology of cells in each experimental group at 72 h (200 ×)

2.2 细胞增殖

研究表明，对照组在不同雌激素浓度下细胞的OD值无明显差异；培养12 h时，50 μmoL/L雌激素组的OD值显著高于对照组及100 μmoL/L雌激素组(P<0.05)，且极显著高于200 μmoL/L雌激素添加组(P<0.01)；培养24 h时，对照组OD值极显著高于其他各浓度雌激素添加组(P<0.01)；培养48、72 h时，对照组OD值极显著高于其他各浓度雌激素添加组(P<0.01)，且100 μmoL/L雌激素组极显著高于200 μmoL/L雌激素添加组(P<0.01)。其余组间差异均不显著。

在不添加雌激素时，对照组在48 h时OD值达到最高，极显著高于其他各时间点(P<0.01)；添加50、100、200 μmoL/L雌激素时，12 h时的OD值极显著高于其他各时间点(P<0.01)。其余组间差异均不显著。表1

表1 不同雌激素浓度下不同时间段时对细胞增殖变化

Table 1 Effects of different estrogen concentrations on cell proliferation at different time points

项目Project时间Time (h)浓度(μmoL/L)Concentration01224487200.17±0.01Ga0.90±0.03Cb0.93±0.05Ca1.06±0.06Aa0.79±0.02Ea500.17±0.10Ga0.96±0.02Aa0.74±0.03Cc0.73±0.03Cc0.46±0.01Ec1000.18±0.10Ga0.87±0.03Ab0.73±0.04Cc0.75±0.05Cc0.44±0.01Ec2000.18±0.10Ga0.82±0.07Ac0.66±0.07Cc0.62±0.01Ce0.35±0.01Ee

注：同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05)，相隔小写字母表示差异极显著(P<0.01)；同行肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05)，相隔大写字母表示差异极显著(P<0.01)

The adjacent lowercase letters of the same column data indicate significant difference (P<0.05), and the lowercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01); the adjacent uppercase letters of the shoulders indicate significant difference (P<0.05), which is separated by uppercase letters.The difference was extremely significant (P< 0.01)

2.3 细胞周期

研究表明，对照组在添加不同浓度雌激素时其G1、S、G2期无明显差异；培养至12 h时，对照组及添加50 μmoL/L雌激素组其G1期极显著高于其他两组(P<0.01)，对照组S期极显著高于其他各组(P<0.01)，添加100 μmoL/L雌激素组其G2期极显著高于其他各组(P<0.01)；培养至24 h时，添加100、200 μmoL/L雌激素组G1期极显著高于其他两组(P<0.01)，添加50 μmoL/L雌激素组S期极显著高于对照组及其他两组(P<0.01)，对照组在G2期极显著高于其他各组(P<0.01)；培养至48 h时，对照组在G1、G2期极显著高于其他各组(P<0.01)，50、200 μmoL/L在S期极显著高于对照组及其他组(P<0.01)；培养至72 h时，添加100 μmoL/L雌激素组其G1期极显著高于对照组及其他各组(P<0.01)，对照组及添加50、200 μmoL/L雌激素组S期显著高于添加100 μmoL/L雌激素组(P<0.05)，对照组在G2期极显著高于其他各组(P<0.01)。其余组间差异均不显著。

不添加雌激素时，细胞培养至48、72 h时其G1期极显著高于对照组及其他各时间组(P<0.01)，24 h时其S、G2期极显著高于对照组及其他各组(P<0.01)；在添加50 μmoL/L雌激素时，细胞培养至72 h时其G1期极显著高于对照组及其他各时间组(P<0.01)，24 h时其S、G2期极显著高于对照组及其他各组(P<0.01)；在添加100 μmoL/L雌激素时，细胞培养至72 h时其G1期极显著高于对照组及其他各时间组(P<0.01)，24 h时其S期极显著高于对照组及其他各组(P<0.01)，12、24 h时其G2期极显著高于对照组及其他各组(P<0.01)。其余组间差异均不显著。表2

表2 不同雌激素浓度下不同时间段时对细胞生长周期变化

Table 2 Effects of different estrogen concentrations on cell growth cycle at different time intervals

项目Project浓度(μmoL/L)Concentration时间(h)Time(h)012244872G1059.20±0.87Ca51.05±0.50Ea20.42±0.51Gb62.44±1.01Aa63.12±0.31Ad5059.63±0.84Ca51.10±0.03Ga19.44±0.26Ic53.89±0.16Ee67.59±1.09Ac10059.46±0.52Ca45.15±0.16Gb29.67±0.48Ia55.14±0.45Ece71.59±0.13Aa20059.64±0.32Ca44.64±0.12Gb30.29±0.60Ia56.65±1.34Ec69.01±0.01AbS019.82±0.29Ea32.73±1.08Ca45.48±0.08Ac19.87±0.86Ee20.11±1.69Eab5019.88±0.32Ga22.49±1.18Ee52.98±0.98Aa35.92±1.59Ca19.80±1.38Gab10019.65±0.40Ga24.77±0.10Ec39.65±2.66Ad29.80±0.41Cc18.87±0.08Gb20019.82±0.66Ga25.18±0.33Ec40.35±2.88Ad33.85±1.29Ca21.16±0.01GaG2020.97±0.68Ca16.21±1.58Ee34.10±0.42Aa17.68±0.14Ea16.77±1.38Ea5020.48±1.15Ea24.91±0.35Cc27.57±1.24Ac10.13±1.37Ge12.61±0.29Ic10020.88±0.91Ca30.07±0.05Aa30.66±2.17Ac15.05±0.04Ec9.54±0.21Ge20020.53±0.53Ca30.16±0.21Ac29.35±2.27Ab9.49±0.05Ee9.83±0.01Ee

注：同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05)，相隔小写字母表示差异极显著(P<0.01)；同行肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05)，相隔大写字母表示差异极显著(P<0.01)

The adjacent lowercase letters of the same column data indicate significant difference (P<0.05), and the lowercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01); the adjacent uppercase letters of the shoulders indicate significant difference (P<0.05), which is separated by uppercase letters.The difference was extremely significant (P< 0.01)

3 讨 论

3.1 雌激素对细胞增殖的影响

试验研究表明，添加雌激素与对照组相比可以促进乳腺上皮细胞的增殖。乳腺上皮细胞是乳腺实质的腺泡和导管系统的重要组成部分[8]，是研究乳腺生长发育和泌乳机制的重要体外模型。激素对乳腺上皮细胞功能影响的研究在近年来逐渐深入，雌激素可能通过自分泌或旁分泌的方式，诱导乳腺上皮细胞分泌其他生长因子[9-10]，然后进入到血液中，发挥促进乳腺上皮细胞增殖的作用。研究表明雌激素可以促进乳腺上皮细胞的增殖[11-12]。穆莹等[13]的研究表明，与对照组相比，添加大豆异黄酮组奶牛乳腺上皮细胞的增殖能力与活力显著增强。刘春龙等[14]的研究表明,大豆异黄酮在一定浓度范围内有促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及提高抗氧化水平的作用。与试验的研究结果一致。

低浓度50 μmoL/L雌激素具有促进牛乳腺上皮细胞增殖的作用，但在高浓度100 、200 μmoL/L雌激素环境下，细胞增殖的能力极显著低于对照组。可能是大量的雌激素与其特异性受体发生了结合，使由旁分泌产生的生长因子大量的增加，出现了高浓度的雌激素抑制细胞增殖的现象。陈静、Vandenberg、曹艳红[15-17]等的研究表明，低浓度的雌激素能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖，高浓度可以对奶牛乳腺上皮细胞造成损伤。

试验中，添加50 μmoL/L雌激素组在12 h时与对照组相比显著促进乳腺上皮细胞的增殖，而在24、48、72 h时与对照组相比极显著的抑制了乳腺上皮细胞的增殖。可能的原因有两种：一是可能因为乳腺上皮细胞在添加雌激素后，随着培养的时间延长，其细胞自身分泌的雌激素量在逐渐的增加，雌激素的浓度变高，出现了高浓度雌激素抑制乳腺上皮细胞增殖的现象；其二可能是因为通过旁分泌和自分泌形式产生的其他大量的生长因子和细胞的代谢物的不断增加，消耗了细胞生长所需的营养物质，出现了这些生长因子、代谢物与乳腺上皮细胞竞争性抑制的现象，负向调节了雌激素促进乳腺上皮细胞增殖的作用。陈静、Vandenberg[15-16]等的研究表明，乳腺上皮细胞的增殖作用与雌激素的添加剂量和作用时间的长短有关，与试验的研究结果一致。

3.2 雌激素对细胞生长周期的影响

试验研究结果表明，添加雌激素后，乳腺上皮细胞在细胞生长各时期其基本的生长规律与对照组相一致，可能是因为乳腺上皮细胞自身的生长周期规律不受外界激素或其他生长因子等所影响。在整个细胞周期过程中，细胞都要经历由G1-S-G2-M期的历程[18]。

在12 h时，各浓度雌激素添加组与对照组相比其细胞周期极显著的由G1、S期转向了G2期，G2期的细胞比例快速上升，大量的细胞停留在这个时期。可能是雌激素的添加加快了细胞的有丝分裂，促进了细胞的增殖。陈秀霞等[19]研究发现雌、雄激素联合作用还能促进G2/M期细胞增多，可能是通过加快细胞周期进程从而促进成骨细胞的增殖和分化。

在12 h时，100、200 μmoL/L雌激素添加组G1期显著高于50 μmoL/L雌激素添加组，S期、G2期极显著高于50 μmoL/L雌激素添加组。说明高浓度的雌激素在一定的时间下可以加快细胞周期G1期向S、G2期的转化。但此时各浓度雌激素通过复杂的信号系统对细胞周期的影响有待于进一步深入研究。

试验中，在24、72 h时各浓度雌激素组的细胞生长周期相比于对照组显著的阻滞在G1期，48 h时各浓度雌激素组的细胞生长周期相比于对照组极显著的阻滞在S期。可能原因有两种，由于雌激素的浓度随着时间的增加变高后，一是可能是高浓度雌激素通过诱导乳腺上皮凋亡并将细胞阻滞在G1期，使细胞不能进入S期进行DNA合成，最终使乳腺上皮细胞的体外增殖受到抑制；其二可能是细胞内的DNA发生了损伤，细胞开始启动损伤感应机制[20-21]，使细胞的生长发生了阻滞，而后开始DNA修复，修复完成后的细胞方能进入下一个周期，在此过程中，修复不成功的细胞则会出现凋亡。

4 结 论

添加雌激素可以促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖；且在50、100、200 μmoL/L这三种浓度的雌激素添加组中，50 μmoL/L雌激素添加组在12 h时促进乳腺上皮细胞增殖的效果最好，细胞的增殖情况比0 μmoL/L雌激素添加组增高了6.25%，其他各添加组在不同时间点均抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖，且随着浓度和时间的不断增加，细胞的增殖能力不断减弱。

添加雌激素不影响奶牛乳腺上皮细胞在各时期时细胞生长的基本规律。在12 h时，各浓度雌激素添加组的细胞周期由G1、S期向G2期转化较快，且100、200 μmoL/L高浓度雌激素添加组比50 μmoL/L低浓度雌激素添加组转化较快；在24、48 h时，各浓度雌激素添加组的细胞周期被阻滞在S期；在72 h时，各浓度雌激素添加组的细胞周期被阻滞在G1期。