化学法提取红树莓果渣可溶性膳食纤维的工艺优化

,*

(1.烟台大学生命科学学院,山东烟台 264003;2.滨州医学院药学院,山东烟台 264003;3.国家葡萄酒及白酒、露酒产品质量监督检验中心,山东烟台 264003)

红树莓(RubusideausL.)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)浆果,颜色鲜艳、口感细腻且风味独特,但常温下不耐贮藏且运输困难,极易腐烂,一般加工成果汁、果酱、果酒等产品[1-3],且加工后残留果渣的45%均为纤维素部分,其中可能含有纤维素、半纤维素、果胶、木质素和蛋白质等[4]。目前,食品工业越来越重视回收和利用副产品以改善有机废弃物对环境的影响[5]。食品加工后的废渣所占比重较高,尤其是水果加工业,榨汁后的果渣比重范围为15%～50%[6],回收再利用这些植物加工废弃物,不但可以提高食品加工的总利润,还可以实现食品工业的绿色生产和可持续发展。鉴于此,苹果、刺梨和石榴等果渣中膳食纤维的提取再利用近期受到较多的关注[7-11]。

膳食纤维是20世纪80年代最早明确的与健康相关的成分之一,是由一组异质性化合物组成的混合物,在人类上消化道系统不能被消化酶消化[12],其中,果胶和树胶为可溶性膳食纤维(Soluble Dietary Fiber,SDF),纤维素、大部分半纤维素和木质素为不可溶性膳食纤维(Insoluble Dietary Fibre,IDF)[12-14]。国内外研究表明,SDF具有降低血液胆固醇、改善葡萄糖耐受性以及降低血糖反应的功效[15-16],IDF具有增加粪便体积、促进正常通便、减少肠道转运的能力[17-18]。鉴于此,富含膳食纤维的红树莓果渣可直接作为添加剂应用于食品生产,如替代50%的面粉进行糕点烘焙提升糕点的膳食纤维含量[19]。

截止目前,国内外对红树莓果渣膳食纤维提取工艺的系统优化尚未报道。本实验以红树莓酒精发酵后的果渣为原料,分别以酸法(盐酸)和碱法(氢氧化钠)提取SDF,通过单因素实验结果结合响应面法优化提取红树莓果渣SDF的最佳工艺参数,以期使用较少的提取溶剂、较短的提取时间和较低的提取温度获得可观的SDF,为红树莓果渣膳食纤维的提取及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓果渣 山东黑尚莓生物技术发展有限公司;氢氧化钠 天津市鼎盛鑫化工有限公司;浓盐酸 石家庄市锐博科技有限公司;95%乙醇 北京北化福瑞科技有限公司;浓硫酸 莱阳经济技术开发区精细化工厂;硫酸铜 国药集团化学试剂有限公司;硫酸钾 国药集团化学试剂有限公司;硼酸 国药集团化学试剂有限公司;乙酸镁 国药集团化学试剂有限公司;以上试剂皆为分析纯。

KQ-500 DE型数控超声波清洗器 昆山舒美超声仪器有限公司;Synergy UV超纯水制备仪器 法国Millipore公司;TGL16 M凯达离心机 湖南凯达科学仪器有限公司;GR-240热空气消毒箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;HH-6恒温水浴锅 北京华瑞新成科技有限公司;BJ-400多功能粉碎机 德清拜杰电器有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵 郑州世纪双科实验仪器有限公司;ME204E电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;KSW-40-11箱式马弗炉 龙口市文太电炉制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.1.1 酸法提取步骤 红树莓果渣烘干、粉碎、过0.22 mm(60目)筛后,准确称取0.5 g果渣,以一定料液比加入一定体积的质量分数分别为1%、2%、3%、4%和5%的盐酸溶液,以一定的提取温度水浴提取一定时间后过滤,滤液在热空气消毒箱中60 ℃温度下加热蒸发至原体积的1/5,然后用4倍体积的95%乙醇沉淀,静置过夜,5000 r/min离心15 min,离心后弃掉上清液,将沉淀在70 ℃环境下烘干至恒定的重量得SDF[20-22]。

1.2.1.2 碱法提取步骤 红树莓果渣烘干、粉碎、过0.22 mm(60目)筛后,准确称取0.5 g果渣加入一定体积的浓度分别为2、5、8、11、14 g/L的氢氧化钠溶液,以一定的提取温度水浴提取一定时间后过滤,使用盐酸调节滤液pH为4.5后再次抽滤,然后调节滤液pH为中性并浓缩至原体积的1/5,用4倍体积的95%乙醇沉淀,静置过夜,5000 r/min离心15 min,离心后弃掉上清液,将沉淀在70 ℃环境下烘干至恒定的重量得SDF[23]。

1.2.2 单因素实验 膳食纤维化学提取法的得率主要受提取液成分、pH、液料比、提取温度和提取时间等工艺因素的影响[8],因此本实验分别选取盐酸和氢氧化钠溶液为提取液,以提取液浓度、液料比、提取温度和提取时间为影响因素设计单因素实验。

1.2.2.1 酸水解单因素实验 选取盐酸浓度为4%,液料比为20∶1 (mL/g),提取温度为60 ℃,提取时间为20 min作为各因素的固定水平,分别以盐酸提取浓度(1%、2%、3%、4%、5%,质量分数),液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g),提取温度(40、50、60、70、80 ℃)和提取时间(20、40、60、80、100 min)进行单因素实验,探讨酸法提取对红树莓果渣SDF得率的影响。

1.2.2.2 碱水解单因素实验 选取氢氧化钠浓度为8 g/L,液料比为20∶1 (mL/g),提取温度为45 ℃,提取时间为20 min作为各因素的固定水平,分别以氢氧化钠溶液提取浓度(2、5、8、11、14 g/L)、液料比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL/g)、提取温度(30、35、40、45、50 ℃)和提取时间(20、40、60、80、100 min)进行单因素实验,探讨碱法提取对红树莓果渣SDF得率的影响。

1.2.3 两种提取工艺的比较 根据GB 5009.88-2014分别测定酸法和碱法提取物中SDF的含量,其中蛋白质的测定依据GB 5009.5-2016,灰分的测定依据GB 5009.4-2016,比较分析两种提取方法获得产品的纯度;结合单因素实验获得的不同提取条件下酸法和碱法的平均实际得率,确定一种较优的化学提取法进行响应面优化。

1.2.4 响应面优化碱法提取工艺试验 在碱法单因素实验的基础上,采用Box-Behnken 4因素3水平的设计方案,以红树莓果渣SDF得率为响应值,以提取温度(A)、提取时间(B)、氢氧化钠浓度(C)和液料比(D)为考察因素做优化试验,因素和水平详见表1。

1.2.5 指标计算

图1 提取温度、提取时间、盐酸浓度和液料比对SDF得率的影响Fig.1 Effects of temperature,time,concentration of HCl and liquid-solid ratio on the yield of SDF

1.2.5.1 SDF得率计算公式

式中:m是称重的红树莓果渣粉的质量,g;m1是干燥的空离心管的重量,mg;m2是离心管和干燥称重的SDF质量之和,mg。

1.2.5.2 SDF提取物纯度计算公式

式中:M是称重的SDF提取物的质量,mg;M1是提取物中蛋白质的质量,mg;M2是提取物中灰分的质量,mg。

1.3 数据分析

实验进行三次重复,Microsoft excel 2012处理数据;SPSS 18.0进行单因素方差分析,并进行LSD多重比较;Design-Expert 8.0完成响应面优化试验设计及数据分析。

2 结果与讨论

2.1 红树莓果渣SDF酸解条件的单因素实验

2.1.1 提取温度的影响 由图1a可知,随着提取温度的升高,SDF得率呈上升趋势,尤其是60～70 ℃范围内SDF得率大幅度增长,但80 ℃时并没有显著(P>0.05)提高SDF得率,说明此时高温一方面加大了溶液的黏度,限制了膳食纤维的进一步溶出;另一方面高温在一定程度上改变了膳食纤维的结构,降低了其醇沉效果[8]。考虑到温度越高,能耗越大,最终选取70 ℃为最佳提取温度。

2.1.2 提取时间的影响 由图1b可知,随着提取时间延长,SDF得率呈先上升后下降的趋势,在60 min时SDF得率显著增加(P<0.05);超过60 min后SDF得率开始下降,说明60 min后部分多糖开始被酸水解而不能被乙醇沉淀。最终选取60 min为最佳提取时间。

2.1.3 盐酸质量分数的影响 由图1c可知,盐酸浓度在1%～2%范围内SDF得率显著增加(P<0.05),当浓度大于2%时,SDF得率随盐酸质量分数增加呈下降趋势,且浓度为4%时得率显著降低(P<0.05),4%以后提取效果趋于稳定。由于酸性条件下原果胶水解而变成水溶性果胶,随着酸浓度增加SDF得率不断增加,当酸浓度达到一定质量分数时,会引起果渣中蛋白质变性而凝固,包裹水溶性膳食纤维阻碍其释出[8],导致SDF得率下降;另外,当酸度过高时,可溶性膳食纤维自身也会发生降解[20]。因此,当盐酸浓度达到2%时,SDF得率已经达到最大值,不宜提升盐酸浓度进行SDF的提取。最终选取2%为最佳盐酸浓度。

图2 提取温度、提取时间、氢氧化钠浓度和液料比对SDF得率的影响Fig.2 Effects of temperature,time,NaOH concentraten and liquid-solid ratio on the yield of SDF

2.1.4 液料比的影响 图1d结果显示,液料比在10∶1～15∶1 (mL/g)范围内SDF得率显著增加(P<0.05),但15∶1～30∶1 (mL/g)范围内,随着液料比降低SDF得率并没有显著变化(P>0.05),说明当液料比为15∶1 (mL/g)时,SDF由红树莓果渣向提取液扩散速率已经达到最大,溶解量亦达到最大,而液料比进一步降低时,水溶性膳食纤维得率变化不大,其溶解速率已达到平衡。最终选取15∶1 (mL/g)为最佳酸解的液料比。

2.2 红树莓果渣SDF碱解条件的单因素实验

2.2.1 提取温度的影响 由图2a可知,在30～35 ℃时,随着提取温度的升高,红树莓果渣SDF的得率缓慢增加,但并不显著(P>0.05);随着提取温度的进一步升高,分子热运动的加快加速了SDF的溶出速度,40 ℃温度下的得率显著高于30 ℃的得率(P<0.05);当温度高于40 ℃时,SDF得率呈下降趋势,说明高温导致SDF的部分成分降解,导致SDF得率的降低[8]。因此提取温度不宜超过40 ℃。

2.2.2 提取时间的影响 由图2b可知,在设置的提取时间内,红树莓果渣SDF得率随浸提时间的延长呈现先增加后降低的趋势。20～40 min的水解并未出现显著性增加,当提取时间为60 min时,SDF得率显著高于40 min(P<0.05),达到最大值,提取时间为80 min,SDF得率显著低于60 min(P<0.05),说明碱液长时间的作用破坏了红树莓果渣SDF的结构,使其不完全醇沉或无法醇沉,致使SDF得率减少。因此最佳提取时间在60 min左右。

2.2.3 氢氧化钠浓度的影响 由图2c可知,在浸提液氢氧化钠浓度2～5 g/L范围内,氢氧化钠浓度的增加并未显著(P>0.05)影响红树莓果渣SDF的得率,而8 g/L的得率显著(P<0.05)高于5 g/L,达到最大值。随着浸提液氢氧化钠浓度的进一步增加,SDF得率出现显著降低(P<0.05),当氢氧化钠浓度为14 g/L时,其得率比8 g/L降低了27%,说明强碱性条件有利于SDF的浸提,但当氢氧化钠浓度过高时会破坏SDF的结构使其降解,进而影响SDF的得率。因此浸提液氢氧化钠浓度在8 g/L左右时是碱法提取红树莓果渣SDF的较适条件。

2.2.4 液料比的影响 由图2d可知,液料比在15∶1～25∶1 (mL/g)范围内,红树莓果渣SDF得率随着液料比的增加逐渐增加,且25∶1 (mL/g)时的得率显著高于15∶1 (mL/g)时的得率(P<0.05),之后随着液料比的增加,SDF得率趋于稳定,这是因为液料比较低时,提取液的物料黏度较大不利于SDF的过滤造成红树莓果渣SDF得率较低,当液料比增加至25∶1 (mL/g)时,物料黏度对SDF的提取不再产生显著影响,进而随着液料比的进一步增加其SDF得率趋于稳定。综合考虑浸提效果和能源消耗,最终将液料比固定为25∶1 (mL/g)。

图3 酸法和碱法提取红树莓果渣SDF得率Fig.3 SDF yield of raspberry pomace extracted by acid process and alkaline process

2.3 红树莓果渣SDF两种提取工艺比较分析

单因素实验中碱法和酸法工艺条件下的平均得率分别是21.45%±2.30%和3.39%±0.68%,前者是后者的6.33倍,说明碱性条件比酸性条件更有利于红树莓果渣原果胶的水解而变成水溶性果胶,此外碱液破坏氢共价键也会促进各种多糖的溶出,提高SDF得率[8];依据GB5009.88-2014中SDF测定方法分别分析碱法和酸法SDF提取物纯度,结果表明两种工艺条件获得的SDF中蛋白质含量分别为3.66%和3.69%,灰分含量分别为22.56%和20.14%,由此得出平均纯度分别为73.84%和76.17%,碱法的纯度与酸法相近。综合考虑SDF平均得率和纯度,碱法工艺条件SDF提取效果整体优于酸法,因此,本试验以碱法提取的单因素实验结果为依据进行Box-Behnken试验设计。

表2 碱法响应面试验结果Table 2 The results of response surface methodology of alkaline process

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Variance analysis of regression equation by response surface

注:**,极显著(P<0.01);*,显著(P<0.05)。

2.4 响应面优化碱法提取工艺参数试验

2.4.1 碱法Box-Behnken试验结果 试验方案及结果如表2所示。使用Design Expert 8.0对表2的试验结果进行二次多元回归拟合,建立红树莓果渣SDF得率和影响因素之间的回归方程模型为:

SDF得率=24.45-0.22A+0.27B+0.19C+0.24D+0.06AB+0.02AC-0.24AD-0.28BC-0.43BD-0.26CD-1.89A2-1.45B2-1.70C2-2.08D2

试验中B对红树莓果渣SDF得率的影响极显著(P<0.01),而A、C和D的影响为显著(P<0.05);B和D交互项的P值均小于0.05,说明两因素间的交互作用对SDF得率的影响显著(P<0.05),而其它因素间的相互影响均大于0.05,对SDF得率的影响为不显著;F值的比较结果显示,4个因素对SDF得率影响的程度由大至小依次为B、D、A和C。

2.4.2 最佳碱法提取SDF工艺条件的确定 根据回归方程,提取温度(A)、提取时间(B)、氢氧化钠浓度(C)和液料比(D)四个因素间交互作用下的响应面图及等高线图如图4所示。三维响应面可以反映每两个因素间的交互作用,等高线形状越趋向于椭圆形,其交互作用越显著[25-26]。由图4e可知提取时间和液料比之间交互作用显著。随着提取时间和液料比的增加,红树莓果渣SDF得率不断升高;当提取时间延长至61.65 min后,SDF得率达到最大值;当提取时间和液料比继续增加时,SDF得率趋于稳定。当提取时间控制在61.65 min,液料比为25.25∶1 (mL/g)时,能够提高SDF得率。图4a～4d和图4f中各因素在所选取的条件范围内也均有极大值,通过该响应面优化试验分析可以得到提取红树莓果渣SDF的最优工艺参数。

由此确定最佳提取工艺条件为:提取温度是39.71 ℃,提取时间是61.65 min,氢氧化钠浓度是8.13 g/L,液料比是25.25∶1 (mL/g),此时的红树莓果渣预测SDF得率为24.48%。将以上条件校正为:提取温度40 ℃,提取时间62 min,氢氧化钠浓度是8.13 g/L,液料比是25∶1 (mL/g)。红树莓果渣烘干、粉碎、过0.22 mm(60目)筛后,准确称取0.5 g果渣在该提取条件下进行3次验证试验,红树莓果渣的平均得率为 24.03%±1.01%,与理论预测值相差0.45%,说明该回归模型与实际情况的拟合较好,充分验证了所建模型的准确性,得到的响应曲面优化的工艺条件可行,具有一定的实用价值。

3 结论

酸法和碱法均可应用于红树莓果渣SDF的提取,提取物SDF纯度较高,平均纯度分别为73.84%和76.17%,但是碱法得率明显高于酸法,分别为21.45%±2.30%和3.39%±0.68%。因此,碱法提取效果整体优于酸法。

通过对碱法提取进行响应面优化分析,所获得红树莓果渣SDF提取优化工艺参数最终确定为:提取温度40 ℃,提取时间62 min,氢氧化钠浓度8.13 g/L,液料比25∶1 (mL/g)。在此工艺参数条件下进行验证,红树莓果渣的SDF平均得率为 24.03%±1.01%,与理论预测值24.48%基本相符,充分验证了所建模型的准确性,得到的响应曲面优化的工艺条件可行,可为红树莓果渣SDF的提取及应用提供一定的理论参考。