三叶青藤叶配方颗粒急性毒性试验

谢 平 ，余文静 ，陈 丹 ，洪丽婷 ，刘秀棉 ，熊朝栋 ，黄心平

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.宁化县益珍农业科技有限公司，福建 三明 365406）

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.）为葡萄科崖爬藤属，是我国特有的珍稀药用植物和民间常用药。《海南植物志》［1］及《中国植物志》［2］中记载三叶青的叶（或全株）可供药用。现代药理实验表明，三叶青具有抗肿瘤、抗炎、解热镇痛、抗病毒、保肝以及免疫调节等多种药理作用，近年来在抗炎和辅助抗肿瘤方面发挥积极作用［3-4］。三叶青藤叶配方颗粒是以三叶青藤叶饮片为原料，经水煎煮制备而成，既可随证加减，又具有免煎易服、质量可控等优点［5］。急性毒性试验是评价24 h内1次或多次给药后动物表现出的毒性反应，通过测定半数致死量观察动物急性毒性中毒表现［6-9］。为评价三叶青藤叶配方颗粒用药的安全性，实验依据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》［9］，采用最大耐受量（MTD）试验法，通过最大给药浓度及最大小鼠灌胃体积给药，观察小鼠的急性毒性反应，初步评价三叶青藤叶配方颗粒的口服用药安全性，为三叶青藤叶配方颗粒的安全性评价奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 动物 SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体质量21～25 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养环境温度（22±2）℃，环境湿度（55±5）%，保持室内自然通风，自由饮食、饮水。实验前置于饲养环境中适应7 d。SPF级医学实验动物环境设施由福建中医药大学实验动物中心提供，使用许可证号SYXK（闽）2014-0005。实验动物处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试药 三叶青藤叶（宁化县益珍农业科技有限公司提供，福建中医药大学中药鉴定教研室范世明高级实验师鉴定）；三叶青藤叶配方颗粒（自制，批号20160416）；0.9%氯化钠注射液（福州海王福药制药有限公司，批号60929A45）。

1.3 仪器 ARA520百分之一电子天平、AR2140万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

2 实验方法

2.1 药液的配制 称取三叶青藤叶配方颗粒，加25 mL蒸馏水配制成浓稠混悬液，并以灌胃针测试至可吸取的浓稠度，即得三叶青藤叶配方颗粒的最大给药浓度药液（0.76 g／mL）。

2.2 小鼠急性毒性LD50预实验 取昆明小鼠40只，体质量21～24 g，雌雄各半，分为2组，实验前分笼饲养3 d后，给药前禁食不禁水12 h，灌胃给药三叶青藤叶配方颗粒药液1次（30.4 g／kg），连续观察7 d，拟找出100%死亡率，进行Dm值的测定。

2.3 急性毒性最大耐受量法试验 取昆明小鼠40只，体质量22～25 g，雌雄各半，雌雄小鼠分开后，分别随机分为给药组和空白组，每组各20只，给药前禁食不禁水12 h。以40 g／kg蒸馏水灌胃空白组1次，以30.4 g／kg三叶青藤叶配方颗粒药液灌胃给药组1次。给药后密切观察6 h内2组小鼠状况，连续观察14 d，每天1次，观察记录小鼠外观、行为活动、精神状态、摄食、饮水、排泄情况、是否有中毒症状及死亡情况，同时称量给药前和给药后第1、2、3、4、5、7、9、11、14 天体质量，记录体质量变化。若有小鼠死亡，立刻将死亡小鼠解剖，肉眼观察小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器。第14天处死各组小鼠，对其主要脏器进行肉眼观察比较，若发现肉眼可见病变，则进行病理组织形态学检查，同时称取各脏器湿重，计算脏器指数。

2.4 检测指标 计算2组小鼠给药后14 d内累计死亡数；记录给药组小鼠急性毒性反应（皮毛、心血管系统、呼吸系统、胃肠系统等系统反应症状及自发活动变化症状）；2组小鼠体质量变化；2组小鼠脏器指数变化。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件对数据进行处理分析。计量资料符合正态分布以（）表示，采用t检验。

3 结 果

3.1 2组小鼠急性毒性LD50预实验 结果表明，2组小鼠状况良好，无死亡，无法测出LD50，故选择最大耐受量（MTD）法实验。

3.2 给药组小鼠给药后症状观察 实验结果表明，给药后10～15 min，给药组小鼠行动减缓，对外界刺激反应迟钝；25～30 min后，开始逐渐恢复正常活动及饮食饮水，在鼠笼内攀爬，观察期内无动物死亡，2组小鼠均未出现其他急性毒性反应症状。小鼠急性毒性反应症状谱，见表1。

表1 小鼠急性毒性反应症状谱

3.3 小鼠急性毒性MTD值测定 根据三叶青藤叶配方颗粒的小鼠灌胃给药量，且最大耐受量（MTD）法实验过程中，2组均未出现小鼠死亡情况。因此，最大耐受剂量大于最大给药量 30.4 g／（kg·d）（0.76 g／mL×0.4 mL／10 g×1 次），根据三叶青成人民间服用量15 g／d计算，相当于是临床按60 kg体重计算每公斤体质量日用量的121.6倍以上。

3.4 2组小鼠给药后第14天脏器指数比较 给药后第14天，脱颈处死2组小鼠，解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾，称取各脏器湿重，计算脏器指数。实验结果表明，与空白组比较，给药组的小鼠各脏器的颜色、质地无明显差异，脏器指数差异无统计学意义（P＞0.05）。 结果见表 2。

表2 2组小鼠给药后第14天脏器指数比较（）

表2 2组小鼠给药后第14天脏器指数比较（）

肾10.21±1.49 13.90±1.00 9.59±0.83 9.66±0.65心4.08±0.27 4.11±0.46 3.85±0.59 4.01±0.65肝40.33±5.19 41.10±2.12 38.76±3.31 41.32±2.16脾1.98±0.14 2.51±0.41 2.04±0.23 2.45±0.65肺5.77±1.05 6.08±0.80 5.93±0.66 5.91±1.48组别空白组给药组性别雌性雄性雌性雄性胸腺2.61±0.09 2.30±0.44 2.69±0.52 2.40±0.23

3.5 2组小鼠给药前后体质量变化比较 称量给药前和给药后第 1、2、3、4、5、7、9、11、14 天体质量，记录体质量变化。经统计分析，2组雌、雄小鼠各时间组间体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。

表3 2组小鼠给药前后体质量变化比较（）g

表3 2组小鼠给药前后体质量变化比较（）g

第4天27.30±1.67 27.20±1.26 27.60±1.22 27.60±1.41给药前22.67±0.94 22.70±0.07 22.00±0.94 22.40±1.16第1天24.30±1.06 24.50±1.72 24.00±0.79 24.50±1.33第2天25.40±0.24 25.90±1.88 25.80±1.39 25.50±1.50第3天26.90±1.88 26.30±1.75 26.90±1.33 26.80±1.10组别空白组给药组性别雌性雄性雌性雄性第5天28.10±1.64 28.60±0.59 28.70±1.41 28.50±0.89第11天31.90±1.56 34.20±0.81 31.50±1.32 34.60±1.76第7天29.00±0.13 31.60±0.50 29.20±0.81 32.90±1.00第9天30.70±1.63 33.00±1.40 30.60±0.78 33.60±1.37第14天32.70±1.54 35.00±1.26 32.80±1.15 35.60±0.78组别空白组给药组性别雌性雄性雌性雄性给药后给药后

4 讨 论

实验研究证明，三叶青藤叶配方颗粒具有良好的抗炎作用［10］。经初步安全性预实验，以最大给药浓度、最大给药体积小鼠1次口服灌胃，无Dm值（100%死亡率），故选择MTD试验法进行三叶青藤叶配方颗粒急性毒性试验。根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》，计算小鼠最大耐受药量倍数，以耐受人临床用量的100倍以上为安全，根据三叶青成人民间服用量15 g／d计算，小鼠最大耐受药量是临床用量的121.6倍以上，提示三叶青藤叶配方颗粒毒性低，口服用药安全。