蛴螬提取物对实验性兔视网膜静脉阻塞HGF、VEGF表达的影响※

●梁凯霞 蒋鹏飞 彭 俊 彭清华,3▲

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)发病率较高，多发于50～70岁中老年人，发病率无明显性别差异，常单眼发病，以视网膜静脉怒张迂曲为特征，受累静脉区域有广泛的出血、渗出或水肿。新生血管(CNV)是RVO的常见并发症，治疗困难，严重影响视功能，约15%的患者并发新生血管性青光眼。

蛴螬具有破瘀、散结、止痛、解毒之功，《药性论》言其“汁滴目中，去翳障，主血，止痛”。因此，蛴螬常用于目疾的治疗。前期研究发现蛴螬提取物可促进RVO出血的吸收、抑制CNV的形成[1-2]，但具体作用机制尚不明确。为进一步探讨蛴螬抑制CNV的作用机制，本文观察了蛴螬提取物对RVO模型HGF、VEGF表达的影响。

1 实验材料

1.1实验动物选取40只体重为1.8～2.3kg的健康实验性兔，不限雌雄(动物许可证号：湘医动字第30-015号)。

1.2主要实验药品和试剂蛴螬提取物(参考阳长明的方法[3]制备)；复方血栓通片；0.4%倍诺喜滴眼液；兔抗HGF多克隆抗体、兔抗VEGF多克隆抗体(均由武汉博士德生物工程有限公司提供)。

1.3主要实验仪器裂隙灯显微镜(苏州六六视觉科技有限公司，型号：YZ5S)；YZZOT型显微镜(苏州医疗器械设备厂)；PCR仪(德国Biometra)；Mias-2000图形分析系统(四川川大智胜软件股份有限公司)；Leica石蜡切片机(徕卡，型号RM2235)。

2 实验方法

2.1动物分组采用随机数字表法将40只实验性兔随机分为空白组、模型组、复方血栓通组、蛴螬提取物组4个组，每组均为10只动物。

2.2造模方法模型组、复方血栓通组、蛴螬提取物组动物应用光化学动力法[4]制作实验性RVO模型，具体操作为：双眼散瞳后，麻醉动物，将动物头固定于裂隙灯前，安置三面镜，以裂隙灯显微镜观察动物眼底，激光器指示光斑定位于视盘边缘的静脉后，自动物耳缘静脉缓慢推入20%荧光素钠注射液(0.3mL/kg)，30s内推完，注药后用激光照射双侧视网膜静脉，同时注意避开伴行的动脉，远端静脉有明显的扩张时即为造模成功。

2.3动物给药方法空白组、模型组以蒸馏水5mL/kg灌胃；复方血栓通组以复方血栓通0.1g/kg溶于蒸馏水中制成混悬剂，5mL/Kg灌胃；蛴螬提取物组以蛴螬提取物0.56g/100g灌胃。每日1次，持续至动物取材。于造模后1wk、3wk每组各随机处死5只动物取材。

2.4取材方法将实验性兔耳缘静脉注射空气处死后，摘除两只眼球，在手术显微镜下去除眼前节及玻璃体等多余组织，剥离激光斑部位视网膜，酒精脱水，石蜡包埋，切片，烘干备用。

2.5测试检测将取材的切片行苏木精-伊红染色，做免疫组化组织学检测HGF与VEGF表达，每张切片均选取免疫组化阳性染色最多的4个视野框，用Mias-2000图形分析系统测量视野框内HGF与VEGF的平均光密度，在光学显微镜下主要观察视网膜组织变化。

3 结果

造模后1wk：空白组视网膜各层结构清晰，排列正常，HGF与VEGF少量表达于视网膜，与模型组、复方血栓通组、蛴螬提取物组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组视网膜组织水肿，细胞排列较乱，尚无新生血管索，HGF与VEGF大量表达于视网膜，与复方血栓通组、蛴螬提取物组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；复方血栓通组、蛴螬提取物组视网膜组织水肿，细胞排列紊乱，HGF与VEGF少量表达于视网膜，两组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后3wk：空白组HGF与VEGF表达与造模后1wk时相比，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组出现大量的新生血管索，但HGF与VEGF表达与造模后1wk时相比，差异无统计学意义(P>0.05)；复方血栓通组、蛴螬提取物组视网膜组织水肿减轻，无新生血管索，HGF与VEGF表达均较造模后1wk下降，差异有统计学意义(P<0.05)，但是两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

图1 各组视网膜组织光镜图(HE，×400)

注：①-⑦分别表示空白组、模型组给药后1周、模型组给药后3周、复方血栓通组给药后1周、复方血栓通组给药后3周、蛴螬提取物组给药后1周、蛴螬提取物组给药后3周视网膜HE染色。

表1 各组HGF与VEGF阳性表达的平均光密度值

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较：◇P<0.05；与1wk时比较：▲P<0.05。

4 讨论

视网膜静脉阻塞发生后，血液回流障碍，视网膜代偿性形成新生血管[5-7]，新生血管管壁仅有一层细胞构成，极易发生出血[8-9]，引起视力下降，持续的出血会对视网膜造成毒性损伤[10-11]。现代药理研究认为蛴螬能够治疗RVO所致的视网膜病理损伤[1-2]。

视网膜静脉阻塞属祖国医学“络瘀暴盲”范畴，《银海精微·肾经主病》认为本病病机为“属相火上浮，水不能制。”《银海指南·血病论》曰：“目得血而能视，血者气之所化也。故血盛则形强，人生所赖，惟斯而已。润经络，泽脏腑，养筋骨，充满一身，而目受其荫，固宜通疏，而不宜淤滞者也。”本病的发生与血液瘀滞密切相关，而蛴螬有活血化瘀之功，切中本病病机。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)最先从肝脏部分切除的鼠血清中分离出来，而后从鼠的血小板、肝脏及人的血清中分离出来，所以命名为肝细胞生长因子[13]。在眼部，HGF可由多种细胞产生，刺激眼内多种细胞组织的生长和移行。多项研究[13-15]均说明HGF确实能介导视网膜新生血管形成。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可促进血管内皮细胞分裂，促进新生血管生成[16]。

本研究结果显示：模型组HGF、VEGF表达较空白组明显上调，复方血栓通组与蛴螬提取物组较模型组均有不同程度降低，但复方血栓通组与蛴螬提取物组相比，无统计学差异(P>0.05)，两组的CNV产生均少于模型组，提示复方血栓通组、蛴螬提取物组是通过下调HGF、VEGF以抑制CNV的发生。本研究也存在不足之处，如未将蛴螬按剂量分为不同组别，蛴螬对HGF与VEGF的抑制作用是否与剂量有关仍不得而知。如能进行深入研究，则有望为临床寻找疗效更佳、价格更低廉的药物，创造更大的社会效益与经济效益。