基于微生物发酵的低糖型桑椹精粉制备工艺研究

龙晓珊， 廖森泰， 胡腾根， 邹宇晓， 李 倩， 黎尔纳， 庞道睿， 沈维治

(广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610)

桑椹又名桑果，为桑科落叶乔木桑树(MorusalbaLinn.)的果实[1]，富含氨基酸和维生素等营养成分以及脱氧野尻霉素(DNJ)等活性物质[2-4]，具有抗氧化、降血糖等多种营养和保健功能[5]，已被我国卫生部列入“既是食品又是药品”名录[6-7]。尽管桑椹富含的DNJ等降血糖功能因子，在中医临床和民间食疗养生中应用广泛，但桑椹作为一种天然浆果，其中还含有一定量的葡萄糖和果糖等碳水化合物，如果能通过现代食品加工技术将这些碳水化合物脱除，且尽可能减少DNJ等降血糖功能因子的损失，将有利于改善桑椹的加工性能，拓宽桑椹在食品，尤其是功能食品中的应用领域。乳酸菌和酿酒酵母等微生物可高效脱除桑椹中的碳水化合物[8-10]，同时为发酵产物带来益生菌，有利于提高桑椹的营养价值和保健功能[11]。针对加工过程桑椹发酵液中益生菌损失较大的问题，可加入黄豆辅料作为保护剂，研究表明，黄豆富含异黄酮、卵磷脂、低聚糖、豆甾醇等功能性物质，可以减少冻干过程中益生菌的损失[11-12]。文章以桑椹为研究对象，考察微生物发酵和冻干处理制备的桑椹精粉在理化特性和加工特性方面的主要变化，为拓展桑椹精粉在食品中的应用积累经验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“粤椹大10”新鲜桑椹：成熟度均一(八至九成熟)，无污染、无病虫害。黄豆，黑龙江北纯农产品开发有限公司。

肠膜明串珠菌(Leuconstocmesenteroides)、葡萄酒高活性干酵母(Saccharomycescerevisiae)，广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所菌种保藏中心。

焦性没食子酸(分析纯)，德州润昕实验仪器有限公司；福林酚试剂(分析纯)，上海荔达生物科技有限公司。甲醇、乙腈，色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；琼脂、细菌学蛋白胨、MRS肉汤，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LabSwift- Novasia型水分活度仪，瑞士NOVASINA公司；Agilent 1200 series型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；UitraScan- VIS型自动色差仪，美国HunterLab公司；UV- 1800型紫外分光光度计，日本岛津有限公司；WJL- 628型激光粒度分析仪，珠海欧美克仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品的制备

桑椹原粉(mulberry powder, MP)制备：将采摘得到的八九成熟的新鲜桑椹置于60 ℃烘箱中干燥至恒重后取出，粉碎后过40目筛，获得MP。

发酵液(fermented mulberry，FM)制备：样品制备方法参照文献[10]。取一定质量的桑椹原粉，加入4倍的蒸馏水后混匀，高压灭菌(121 ℃,20 min)。冷却后，接入肠膜明串珠菌(接种量为3.95×108CFU/mL)，将接种后的桑椹浆置于摇床中(30 ℃，150 r/min)，发酵96 h后，再接入酵母菌(接种量为1.76×105CFU/mL)，放置于摇床中发酵6 h(28 ℃，150 r/min)，即得FM。

桑椹精粉(mulberry extract powder)制备：FM冷冻干燥后得到未添加黄豆辅料的桑椹精粉(freeze-dried fermented mulberry, DFM)。黄豆浸泡3 h后经打浆机打成浆，与发酵液混合均匀并冷冻干燥后得到添加黄豆辅料的桑椹精粉(freeze-dried fermented mulberry mixed with soybean, DFMS)，黄豆和发酵液的质量比为1∶5。

1.3.2单糖含量的测定

参考Zheng等[13]的方法并加以适当的改进。将待测样品用适量的水溶解，超声辅助提取30 min，离心10 min(10 000 r/min，4 ℃)，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤后用于高效液相色谱分析单糖含量。色谱条件：检测器为蒸发光检测器，ELSD漂移管温度为45 ℃；色谱柱型号为Shodex Asahipak NH2P- 504E(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱温30 ℃；流动相为体积分数75%乙腈，流速为1 mL/min，进样量为20 μL。以标准品溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算得到样品的单糖含量。

1.3.3粒径的测定

参照文献[14]，采用WJL- 628型激光粒度仪测定样品的粒径，测定D90、D50、D10及分散度，重复3次以上。Dn表示有n%的颗粒粒径小于该数值。

1.3.4水分含量、水分活度、吸湿性的测定

水分含量的测定：采用直接干燥法，称取1～2 g待测样品，105 ℃烘干至恒重后称重计算[15]。

水分活度的测定：使用LabSwift- Novasia型水分活度仪进行测定，重复测定3次以上。

吸湿性的测定：参考蔡延渠等[16]的方法并改进，将饱和NaCl溶液放置在玻璃干燥器中24 h，形成保湿器。称取1～2 g待测样品于已干燥至恒重的称量瓶中，在105 ℃条件下烘干至恒重后称重，放入保湿器中，7 d后，称量样品和称量瓶的总质量。

1.3.5休止角的测定

在水平实验台上放置白纸，漏斗固定在白纸上方，漏斗下端与白纸之间的垂直距离为h；将待测样品放置在漏斗中，让其自由散落到白纸上，直至样品与漏斗下端接触，并形成圆锥形。测量出圆锥形的半径r，h与r的比值即为休止角θ的正切值，从而计算出θ[17]。

1.3.6堆密度的测定

将样品从漏斗中自由散落至10 mL的量筒中，测定样品的质量和体积，至少重复3次，平行样品之间的堆密度差值不超过0.01 g/cm3。

1.3.7色泽的测定

采用全自动色差仪测定样品的色泽[18]。L*表示亮度，值越大，亮度越大；a*表示颜色从绿色(-a*)向红色(+a*)变化，值越大，代表颜色向红色度偏移；b*表示颜色从蓝色(-b*)向黄色(+b*)变化，值越大，代表色泽向黄色度偏移。ΔE是指总色差，计算见式(1)：

(1)

1.3.8桑椹发酵前后活性成分含量测定

1.3.8.1 DNJ含量的测定

样品的提取：精确称取0.5 g样品，加入0.05 mol/L盐酸溶液30 mL，充分混匀后超声30 min，离心后收集上清液，将滤渣用同样的方法再次提取，重复提取3次，合并上清液。

配制10、20、40、200 μg/mL的DNJ标准溶液[19]，样品与标准溶液衍生化后待测。

色谱条件：色谱柱型号为ZORBAX SB- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为体积分数0.1%醋酸和乙腈(体积比60∶40)，进样量为20 μL，流速为1 mL/min，等度洗脱25 min；检测器为DAD型紫外检测器，检测波长254 nm，柱温30 ℃[20]。

1.3.8.2 总多酚含量的测定

配制4、8、12、16、20、24 μg/mL的焦性没食子酸标准溶液[21]。精确称取适量样品，用体积分数60%乙醇溶解，超声辅助提取27 min，离心后取上清液，重复提取3次。用60%乙醇将上清液定容至50 mL，混合均匀后待测。

含量测定：采用福林酚比色法，取1 mL标准溶液(或样品提取物)于10 mL试管中，先加入1 mL福林酚试剂，混合均匀后加入2 mL 0.10 g/mL碳酸钠溶液，混匀，于25 ℃下避光反应60 min后，765 nm测定吸光度。以焦性没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，采用外标法测定多酚含量。

1.3.8.3 花青素含量的测定

样品制备：用酸性乙醇(10 mL体积分数0.1%盐酸溶液，20 mL体积分数95%乙醇)溶解样品，50 ℃超声辅助提取1 h，离心后取上清液重复提取3次。

含量测定：采用pH示差法[22]。14.90 mg/mL氯化钾溶液和0.2 mol/L 盐酸溶液以体积比25∶67混合，并用氯化钾溶液调pH值，得到pH值1.0的缓冲溶液。称取8.20 g醋酸钠用蒸馏水定容至500 mL，用0.2 mol/L盐酸溶液调pH值，得到pH值4.5的缓冲溶液。准确量取5 mL样品2份，分别用pH值1.0、pH值4.5的缓冲液定容至25 mL，平衡2 h后，分别于510、700 nm处测吸光度。花青素得率计算见式(2)。

(2)

式(2)中，吸光度A=(A510 nm,pH1.0-A700 nm,pH1.0)-(A510 nm,pH4.5-A700 nm,pH4.5);26 900为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数;1为光程1 cm;449.2为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的相对分子质量;DF为稀释倍数;V为待测花青素样品储备液体积，mL;M为待测样品质量，mg。

1.3.8.4 总黄酮含量的测定

标准溶液的配制及标准曲线的绘制：准确称取芦丁标准品10 mg，用体积分数60%乙醇溶解并定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的标准品溶液。准确量取芦丁标准品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入体积分数60%的乙醇溶液至体系的体积为5.0 mL，加入0.3 mL质量分数5%的亚硝酸钠溶液，混匀后静置6 min。加入0.3 mL质量分数10%的硝酸铝溶液，混匀后静置6 min，再加入4.0 mL质量分数4%的NaOH溶液，最后用体积分数60%的乙醇溶液定容。混匀后在波长510 nm处测吸光度，以标准溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品的提取及测定[23-24]：样品加入体积分数60%的乙醇，60 ℃利用超声波辅助提取45 min，离心后取上清液。滤渣用同样的条件再次提取，重复提取3次，合并上清液。60%无水乙醇定容至50 mL，取0.6 mL反应，反应条件同标准溶液。

1.4 数据处理

实验数据表示为x±s，采用Word 2010软件和Origin 8.0软件绘制图表。单因素方差分析采用SPSS 19.0软件。

2 结果与分析

2.1 低糖型桑椹精粉制备过程中果糖和葡萄糖含量分析

MP的果糖和葡萄糖含量分别是10.09、526.41 mg/g，发酵处理之后，果糖和葡萄糖含量降低为0(见图1)，这是因为微生物在发酵过程中将桑椹的单糖作为能源物质进行充分利用。DFM和DFMS的果糖和葡萄糖含量明显低于MP，且接近于0，表明低糖型桑椹精粉制备成功。

不同字母表示不同样品同一指标之间差异显著(P<0.05)。图1 低糖型桑椹精粉制备过程中果糖和葡萄糖含量的变化Fig.1 Changes of fructose and glucose content during preparation of low-sugar mulberry extract powder

2.2 低糖型桑椹精粉制备过程中加工特性分析

2.2.1制备过程对桑椹精粉粒径的影响

图2显示了发酵、冻干及添加黄豆辅料处理对桑椹粒径变化的影响。由图2可知，MP平均粒径51.74 μm，有10%的颗粒粒径小于31.90 μm，90%的颗粒粒径小于99.74 μm。当桑椹发酵液经冻干处理后，DFM的平均粒径为19.56 μm，10%的颗粒粒径小于14.86 μm，90%的颗粒粒径小于26.34 μm，表明冻干降低了粉末的粒径。这可能是由于冻干过程中桑椹发酵液内部溶质趋于均匀分布，形成细小的冰晶，在冻干结束后导致其粒径变小。添加黄豆辅料后，DFMS的平均粒径最小，为8.42 μm，其中90%的颗粒粒径小于24.59 μm，10%的颗粒粒径低于2.53 μm，粉末最细腻。相对于桑椹而言，黄豆在冻干过程中形成的冰晶更小，因此粒径更小。而且，糖含量可通过影响冻干和粉碎过程中粉体的黏度从而影响粒径大小。由图1可知，DFM和DFMS的果糖和葡萄糖含量明显低于MP，因此低糖型桑椹精粉的黏度显著小于MP，也是桑椹精粉粒径明显小于桑椹原粉的原因(P<0.05)。粒径的减小，使桑椹粉体的比表面积增大，表面聚合力和吸附力更大，有利于提高粉体的流动性和产品稳定性；同时，有利于增大桑椹活性成分与其提取溶剂的接触面积，提高活性成分的提取率。

不同字母表示不同样品同一指标之间差异显著(P<0.05)。图2 发酵、冻干及添加辅料对桑椹精粉粒径的影响Fig.2 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on particle size of mulberry extract powder

2.2.2制备过程对桑椹精粉粉体特性的影响

DFM的水分含量和水分活度最低，分别为4.85%、0.27，其次是DFMS，水分含量和水分活度分别为8.61%、0.33；而MP的水分含量和水分活度是最高的，分别为14.44%、0.47，见表1。主要是因为MP是使用热泵干燥技术烘干的，而DFM和DFMS是利用冷冻干燥技术干燥的，水分会减少得更多。MP的吸湿性比DFM和DFMS都高，三者的吸湿性依次为7.31%、6.59%、6.38%。由此说明发酵后冻干处理能显著降低桑椹粉的水分含量、水分活度和吸湿性(P<0.05)，提高桑椹粉的贮藏稳定性。

MP的堆密度为0.43 g/cm3，DFMS和DFM的堆密度较小，分别为0.18、0.22 g/cm3，说明发酵后冻干以及添加黄豆辅料都会使桑椹的堆密度明显变小(P<0.05)，桑椹粉体之间空隙变大，容量变小。可能是由于桑椹发酵冻干后，粉体粒径减小，造成粉体比表面积增大，表面聚合力增大，从而导致其堆密度变小。DFMS和DFM的休止角没有显著性差异(P>0.05)，分别为39.31°和38.88°，都显著小于MP(45.51°)，说明发酵后冻干处理会使桑椹粉的休止角明显变小(P<0.05)，粉体流动性变好。由表1可知，与MP相比，DFM和DFMS的吸湿性较低，暴露在空气中吸收的水分较少；粉体颗粒之间的黏着性越小，其摩擦力小，因此流动性更好。总体而言，桑椹经发酵、冻干及辅料优化后，贮藏稳定性提高，粉体流动性更好。

表1 发酵、冻干及添加辅料对桑椹精粉粉体特性的影响Tab.1 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on physical properties of mulberry extract powder

不同字母表示同列数值之间差异显著(P<0.05)。

2.2.3制备过程对桑椹精粉色泽的影响

以MP作为对照组，对比了发酵、冻干及添加辅料等不同处理后色泽的变化，见表2。MP的L*值、a*值、b*值分别为37.22、5.71、2.82，DFM和DFMS的L*值、a*值、b*值都显著大于MP(P<0.05)，说明冻干以及添加黄豆辅料都会使桑椹亮度增加，向红色度和黄色度偏移。这可能与桑椹的粒径有关，粉体粒径越小，其混合均匀度和比表面积越大，色泽改善效果更好[15]。由图2可知，DFM和DFMS的粒径明显小于MP，与表2结果一致。以MP作为对照，DFMS、DFM的色差值分别为10.34、20.06。由以上论述可以说明发酵后冻干及添加辅料处理都会明显改善桑椹的色泽。

表2 发酵、冻干及添加辅料对桑椹精粉色泽的影响Tab.2 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on color of mulberry extract powder

不同字母表示同列数值之间差异显著(P<0.05)。

2.3 低糖型桑椹精粉制备过程中活性物质含量分析

为研究发酵、冻干及添加黄豆辅料等工艺对桑椹DNJ、总多酚、花青素、总黄酮等活性物质含量的影响，对其含量进行了检测分析，如图3。MP和FM的DNJ含量分别为0.68、2.07 mg/g，发酵处理能明显增加桑椹粉DNJ含量，与肖洪等[25]的研究结果一致。而DFM和DFMS的DNJ含量分别为1.39 mg/g和1.03 mg/g，都显著低于FM(P<0.05)，但明显高于MP(P<0.05)，说明冻干降低了DNJ的含量。MP、FM、DFM和DFMS的总多酚含量分别为27.70、28.55、25.83、25.85 mg/g，没有显著性差异(P>0.05)。说明发酵、冻干以及添加黄豆辅料对桑椹总多酚含量没有影响。MP的花青素含量为2.86 mg/g，而FM、DFM和DFMS的花青素含量分别为0.50、0.41、0.47 mg/g，三者没有显著性差异(P>0.05)，说明发酵会对桑椹花青素造成损失，冻干和添加黄豆辅料不会改变桑椹花青素的含量。有研究表明，微生物发酵桑椹时会产生代谢物，与花青素产生反应，将花青素转化为其他大分子物质，使花青素含量明显降低(P<0.05)[26]。MP、FM、DFM、DFMS的总黄酮含量分别为1.24、1.01、1.16、1.30 mg/g，没有显著性的差异(P>0.05)，说明发酵、冻干以及添加黄豆辅料对总黄酮的含量没有影响。研究表明[25]，发酵菌种、接种量、时间、温度等都会对活性物质含量产生一定的影响，发酵条件的改变会使活性物质含量增加或者减少，也有可能不变。

不同字母表示不同样品同一指标之间差异显著(P<0.05)；1-DNJ、总多酚、花青素、总黄酮的计算结果都是将样品折算为同等质量的桑椹干重得到的。图3 发酵、冻干及添加辅料对桑椹精粉活性物质含量的影响Fig.3 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on active substance contents of mulberry extract powder

3 结 论

经发酵、冻干及辅料优化处理后得到的低糖型桑椹精粉，其加工特性得到改善，部分活性物质含量得到提高。低糖型桑椹精粉水分含量、水分活度、吸湿性明显小于发酵前，说明发酵冻干后的桑椹粉更耐储存。与发酵前比，低糖型桑椹精粉堆密度、休止角和粒径都明显降低，粉体流动性变好，粉末更加细腻光滑。与未发酵的桑椹粉比较，发酵冻干后，桑椹精粉色泽变亮，向红色和黄色偏移。发酵提高了桑椹DNJ的含量，但冻干后略微降低；发酵还降低了花青素的含量，但对总多酚、总黄酮含量几乎没有影响；冻干以及添加黄豆辅料对总多酚、总黄酮和花青素含量没有明显的影响。

桑椹的采摘期集中且储藏困难，不易保存，将桑椹进行加工处理是必要手段。本实验证明桑椹经过加工处理后得到的低糖型桑椹精粉具备良好的加工特性，同时部分活性物质含量得到提高，为桑椹的保存和拓宽桑椹在功能食品上的应用，提供了理论依据。