3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生-高效液相色谱法分析香菇多糖的单糖组成

张 萍*， 陈 燕， 刘建波， 尚永辉， 刘 静

(咸阳师范学院化学与化工学院,陕西咸阳 712000)

香菇多糖是一种以β-[1 - 3]葡萄糖残基为主链的葡聚糖化合物，它具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌和抗病毒、抗疲劳、抗氧化和抗衰老、抗辐射等多种药理活性[1 - 2]，是世界上公认的免疫增强剂和干扰素。目前已开发出香菇多糖营养口服液、药用针剂等产品，但有关香菇多糖的单糖组成分析方法研究的文献不多见。测定多糖的单糖组成普遍采用的是气相色谱法(GC)[3]、高效液相色谱法(HPLC)[4]以及色谱和质谱(GC-MS或HPLC-MS)联用法[5 - 6]。GC法样品处理(衍生化)步骤繁琐，耗时长，工作效率不高[7 - 8]，色谱-质谱联用法仪器不具普遍性，因此这两类方法在实际应用中有一定的局限性。相比之下，HPLC法和柱前衍生化技术相结合测定多糖的单糖组成更具实用性。与之适应的糖类衍生化试剂也不断被开发[9]，如吡唑啉酮类[10 - 11]、氨基含氮杂环类[12]、氨基吖啶酮类[13]、芳胺类[14 - 15]等。

3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)是一种在弱酸介质中利用还原胺化反应对糖类物质还原端进行标记的氨基咔唑类衍生化试剂之一，标记上AEC的糖类物质具有很强的紫外吸收及荧光性能，在糖类的衍生化中已有应用[16 - 17]，但对中性糖和糖醛酸的衍生化效果比较，以及用于香菇多糖的单糖组成分析未见报道。本文研究了AEC对不同类型单糖的衍生化效果，并据此建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析香菇多糖的单糖组成，给香菇多糖的研究和产品评价提供了新的方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-10A高效液相色谱仪(日本，岛津公司)，配四元梯度泵、UV检测器和CLASS-VAP色谱工作站；集热式恒温加热磁力搅拌器(杭州惠创仪器设备有限公司)。

单糖标准品：D(+)葡萄糖(Glc)、D(+)半乳糖(Gal)、D(+)木糖(Xyl)、D -甘露糖(Man)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，L(+)鼠李糖(Rha)、D -岩藻糖(Fuc)、D -半乳糖醛酸(GalA)、D -葡萄糖醛酸(GlcA)(纯度≥99%，Sigma公司)，D -阿拉伯糖(Ara)(纯度≥99%，FLUKA公司);3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(纯度95%，上海麦克林生物有限公司)；氰基硼氢化钠(95%，百灵威科技有限公司)；色谱纯乙腈、甲醇(Fisher公司)；冰HAc、二氯甲烷、氨水、无水乙醇等均为分析纯(天津市河东区红岩试剂厂)。实验用水为高纯水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 标准单糖溶液准确称取计算量的各单糖标准品(Glc、Gal、Xyl、Man，Rha、Fuc、GalA、GlcA和Ara)，分别置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容，摇匀后，得0.10 mol/L各单糖储备液，保存于4 ℃冰箱中，用时根据需要混合或用水进行稀释。

1.2.2 AEC衍生化试剂溶液准确称量0.6308 g AEC，加入2.0 mL甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，混匀(浓度为0.3 mol/L)，转移至棕色瓶中保存备用。氰基硼氢化钠溶液：准确称量0.0603 g的氰基硼氢化钠，加入4.0 mL水，溶解，浓度为0.24 mol/L，现用现配。

1.3 香菇多糖的提取和纯化

取干燥香菇100 g，粉碎，加入乙醇700 mL回流提取两次，每次2.5 h，抽滤后，残渣干燥，再加入10倍量水于90 ℃提取两次，每次2.0 h，提取液合并后减压浓缩至200 mL左右。冷却后，加入4倍量无水乙醇，密封保存于4 ℃冰箱静置醇沉24 h。抽滤，滤饼依次用适量的无水乙醇、丙酮和乙醚依次抽洗，干燥后得褐色香菇粗多糖。

将粗多糖配成质量浓度为4%的水溶液，按照糖液∶Sevage试剂氯仿∶正丁醇=4∶1、3∶1(V/V)量加入Sevage试剂，剧烈震摇10 min后，于4 000 r/min 离心10 min，弃去水相与有机相间的变性蛋白，将上层水相同法反复操作7次。用稀NaOH溶液调节水相糖溶液pH为8～9，向其中加入一定量30%H2O2，使H2O2浓度达到5%，混匀后30 ℃水浴2.0 h。将糖溶液装入预先处理好的截留分子量为8 000～10 000的透析袋中，先用自来水流水透析48 h，再用高纯水透析48 h(期间每6 h更换一次水)。将透析过的糖溶液减压浓缩至粘液状，冷却后，加入4倍量无水乙醇，于4 ℃冰箱静置醇沉24 h。离心分离后，残渣依次用适量的无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤分离，干燥后得浅褐色的精制香菇粗多糖。

1.4 单糖的衍生化

1.4.1 标准单糖的衍生参考文献方法[9]并稍加改动。分别准确吸取0.10 mL 0.01 mol/L标准单糖溶液于2 mL反应瓶中，加入0.05 mol/L的AEC衍生化试剂溶液0.10 mL，0.04 mol/L氰基硼氢化钠溶液0.10 mL，冰HAc 0.05 mL，充分混匀后，拧紧瓶盖，于70 ℃水浴条件下反应1.5 h。冷却至室温后，加水0.5 mL，加二氯甲烷1.0 mL，充分振荡，离心，弃去下层有机相，水相重复萃取三次，备HPLC分析。

1.4.2 6种标准单糖混合物的衍生分别准确移取10 μL 0.1 mol/L的6种单糖溶液于2 mL反应瓶中，补加水0.04 mL，分别加入配制好的0.3 mol/L的AEC衍生化试剂溶液100 μL，0.3 mol/L氰基硼氢化钠溶液0.10 mL，冰HAc 50 μL。拧紧瓶盖，于70 ℃水浴条件下反应1.5 h。冷却至室温后，加超纯水0.5 mL，加二氯甲烷1.0 mL，充分振荡，离心，弃去下层二氯甲烷相，水相重复萃取三次，备HPLC分析。

1.5 香菇多糖的水解

称取香菇多糖5 mg于带螺旋塞密封的样品小瓶中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)，在120 ℃条件下加热反应2 h，冷却后，转移至玻璃套管中，抽干，加入1.0 mL水溶解，得香菇多糖水解液。

1.6 香菇多糖样品测试液的制备

取香菇多糖水解液100 μL于5 mL反应瓶中，同1.4.2方法步骤加入100 μL 0.3 mol/L 的AEC衍生化试剂溶液，以及冰HAc 50 μL，同法进行AEC衍生化和后处理，将含衍生物的水相过0.45 μm滤膜后，进行HPLC分析。

1.7 HPLC分析条件

色谱柱为Ultimate LP-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.05 mol/L NH4Ac溶液(pH=5.0)，采用乙腈含量从20%开始，维持2 min后，再在50 min之内增加至30%，之后维持30%不变的梯度洗脱程序；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。

2 结果与讨论

2.1 AEC对不同类型单糖的衍生效果评价

研究中分别对Man、Gal、Rha和Glc 4种六碳糖，Ara和Xyl 2种五碳糖，以及GlcA和GalA 2种酸性糖在相同条件下，按照1.4.1方法进行AEC衍生，衍生产物进行HPLC分析。能代表三种类型单糖的Glc、Ara以及GalA衍生物的HPLC谱图如图1。由图1可见，AEC对Glc和Ara两种中性糖的衍生产物只出现一个对称的色谱峰，说明该衍生产物具有惟一性；而对GalA的衍生产物出现了2种相邻而且峰形不规则的峰，GlcA也有类似情况，说明衍生产物可能有2种；从纵坐标的响应值也可以看出，中性糖衍生物的响应值几乎是酸性糖的5～8倍。说明AEC对中性糖的衍生效果大于酸性糖。可能是由于AEC和还原性单糖的衍生化反应是在加热70 ℃的弱酸性介质中进行的，而酸性糖在此条件下容易发生分子内脱水而形成内酯，从而导致衍生化出现2种无法量化的产物峰。因此，AEC适合于对中性糖的衍生化，不太适合对以糖醛酸为代表的酸性糖进行衍生化。

图1 AEC对不同类型单糖衍生物的色谱图Fig.1 Chromatograms for different types of monosaccharide -AEC derivatives

2.2 AEC-中性单糖衍生物稳定性考察

实验中对由1.4.1方法衍生得到的Glc-AEC衍生溶液分别放置24、48、72、96、120 h 后进行分析测定，记录色谱峰面积，考察衍生物的稳定性。结果表明，Glc-AEC衍生液一周内日间色谱峰峰面积的相对标准偏差(RSD)为4.69%。表明单糖-AEC衍生物在一周之内稳定性良好。

2.3 6种中性单糖-AEC衍生物色谱分离条件选择

2.3.1 流动相pH参考文献报道[16]，选取乙腈-0.05 mol/L NH4Ac溶液为流动相体系的条件下，NH4Ac溶液pH分别为4.0、4.5、5.0时对6种中性单糖-AEC混合衍生物分离的影响。结果表明：随着pH从4.0增大至5.0，6种中性单糖-AEC混合衍生物的分离逐渐改善，同时，出峰时间随之推迟；在pH为5.0时，Man和Gal的分离得到改善，其它峰均得到了完全分离。故确定流动相的pH为5.0。

图2 6种中性单糖-AEC混合衍生物的色谱图Fig.2 Chromatogram of six neutral monosaccharide-AEC derivativesa.Gal；b.Man；c.Glc；d.Ara；e.Xyl；f.Rha.

2.3.2 流动相中乙腈比例对分离的影响以乙腈-0.05 mol/L NH4Ac溶液(pH=5.0)为流动相体系，比较了乙腈比例由20%变到30%时对6种中性单糖-AEC混合衍生物分离的影响。结果表明，当乙腈含量为20%时，6种中性单糖-AEC衍生物均达到了很好的分离，但出峰时间长达90 min；当乙腈含量为30%时，所有单糖-AEC衍生物均在25 min之内出峰，但分离度不佳。综合考虑分离度和出峰时间，采用梯度洗脱，梯度程序见1.7节。由图2可见，梯度洗脱程序下Gal和Man的分离得到了改善，6种中性单糖均得到了满意的分离。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围和检出限分别将浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、0.67、1.00、2.00、10.00 mmol/L的标准单糖混合溶液，按照1.4.2方法分别进行AEC衍生化，并按照1.7的HPLC分析条件进行检测，记录各个浓度下6种单糖-AEC衍生物的色谱峰面积。根据各单糖峰面积和对应浓度进行线性回归，得到的线性方程和相关系数见表1。以0.05 mmol/L的标准单糖混合溶液得到的色谱信息为依据，按照色谱曲线中信噪比(S/N)等于3计算，确定6种单糖的检测限，结果一并列于表1。

表1 6种单糖的线性范围和检出限(n=3)

*Y:denotes the chromatographic peak area;X:denotes the concentration of standard monosaccharides.

2.4.2 回收率和精密度试验按照1.5方法进行水解得到香菇多糖样品水解液。取样品水解液50 μL和50 μL水4份于4个样品瓶中，依次加入0.10 mol/L的6种单糖混合标准溶液0、2、5和8 μL，使各标准单糖添加量依次为0、2.00、5.00和8.00 mmol/L。按照1.4.2方法步骤进行衍生化。按照1.7色谱条件进行分析测定，结果见表2。

表2 6种单糖回收率分析结果(n=3)

*:TheRSDaveragevaluesofeachmonosaccharidearelistedinparentheses.

2.5 香菇多糖的单糖组成分析结果

为了表明方法的实际应用性能，将其用于香菇多糖的单糖组成分析中。按照1.6方法步骤，对香菇多糖进行了单糖组成分析。结果表明：香菇多糖含有本法考察的6种单糖，分别为：Man、Rha、Glc、Gal、Ara和Xyl。将各单糖峰面积带入线性方程，计算其摩尔量，并按照半乳糖摩尔量归一，确定香菇多糖中各单糖摩尔比为：4.69(Man)∶1.23(Ara)∶1.00(Gal)∶0.48(Glc)∶0.17(Rha)∶0.14(Xyl)。该结果和文献报道[18]结果有一定的吻合性，进一步证明了该方法的准确性。

3 结论

研究了AEC对不同类型单糖的衍生化效果，以及单糖-AEC衍生物的稳定性，建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析6种中性单糖的分析方法。该方法对中性单糖的衍生效果较好，衍生物稳定性高，测定的线性范围宽，灵敏度高，重复性好，测定香菇多糖的单糖组成分析结果准确可靠，可应用于香菇多糖和其它多糖单糖组成的测定。