鼻咽癌颈部转移淋巴结基于PD-1检查点阻断原理放疗前后超声变化规律

许亚平　周剑宇　黄珍　李瑾　陈琪　肖春莹

[摘要] 目的 研究鼻咽癌（NPC）患者颈部淋巴结在放疗前后的超声变化规律，探讨PD-1在NPC患者治疗過程中的作用及单克隆抗体在放射治疗NPC中的应用。 方法 通过免疫组织化学染色技术判断PD-1的表达，分析NPC组织中PD-1表达与临床病理参数的关系。分别对PD-1表达阴性和阳性的NPC患者应用彩色多普勒超声检查，同时对普通放疗组（对照组）和加入单克隆抗体治疗组（实验组）在放疗前后的颈部淋巴结转移灶的长径（L）、短径（S）、长径/短径（L/S）、收缩期峰值流速（PSV）、阻力指数（RI）、血流强度进行对比观察。 结果 PD-1阴性患者及阳性患者的实验组和对照组的L、S、PSV和RI指标在放疗4周后均呈现下降趋势，而L/S则呈现升高趋势;治疗4周后PD-1阳性患者的实验组各项超声指标较对照组变化程度明显增加;血流强度检测中，PD-1阳性患者的实验组在治疗4周后实验组0级较对照组比例高，而Ⅱ级较对照组比例小。 结论 PD-1在NPC治疗过程中起着重要的作用，传统放射治疗方法加入单克隆抗体后可以有效提高疗效。

[关键词] 鼻咽癌;多普勒超声检查;程序性死亡受体-1;单克隆抗体

[中图分类号] R739.63;R445.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）23-0039-05

[Abstract] Objective To investigate the ultrasound changes of cervical lymph nodes in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC） before and after radiotherapy， and to explore the role of PD-1 in the treatment of NPC patients and the application of monoclonal antibodies in radiotherapy of NPC. Methods The expression of PD-1 was determined by immunohistochemical staining technique， and the relationship between PD-1 expression and clinicopathological parameters in NPC tissues was analyzed. Color Doppler ultrasonography was performed on NPC patients with negative and positive PD-1 expression， and the long diameter （L）， short diameter （S）， long diameter/short diameter （L/S）， peak systolic velocity （PSV）， resistance index （RI）， and blood flow intensity of the cervical lymph node metastases before and after radiotherapy were compared between the general radiotherapy group （control group） and the monoclonal antibody-treated group （experimental group）. Results The L， S， PSV and RI indexes of PD-1 negative patients and PD-1 positive patients in the experimental group and the control group all showed a downward trend after 4 weeks of radiotherapy， while L/S showed an increasing trend. After 4 weeks of treatment， the ultrasound indexes of the PD-1 positive patients in the experimental group were significantly increased compared with those of the control group. In the blood flow intensity test， the proportion of grade 0 in the experimental group of PD-1 positive patients was higher than that in the control group after 4 weeks of treatment， and the proportion of grade Ⅱ was lower than that of the control group. Conclusion PD-1 plays an important role in the treatment of NPC. The efficacy of traditional radiotherapy can be effectively improved after adding monoclonal antibodies.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma; Doppler ultrasonography; Programmed death receptor-1; Monoclonal antibody

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国最常见的恶性肿瘤之一[1]，其中多数患者發生颈部淋巴结转移，在NPC的诊治过程中，NPC的颈部淋巴结转移在NPC临床分期的判断、治疗方案的制定以及预后评价中起着非常重要的作用[2]。

程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）及其配体（PD-L1）是目前肿瘤免疫治疗的方向之一[3]。PD-1主要在活化T淋巴细胞的细胞膜上表达，在肿瘤细胞表面亦有表达，PD-L1主要在肿瘤细胞的细胞膜上表达，在树突状细胞和巨噬细胞表面亦有表达，PD-1和PD-L1结合可抑制T细胞的活化与增殖，导致肿瘤免疫抑制和免疫逃逸[4]。

目前，包括 BMS-936559等多种针对 PD-L1/PD-1通路阻断的单克隆抗体用于进展期恶性肿瘤的临床试验都在进行当中[5，6]。BMS-936559 是一种高亲和力抗人PD-L1单克隆抗体，能够抑制PD-L1与PD-1、CD80 结合。近期临床试验结果显示，抗PD-1和PD-L1单克隆抗体用于治疗进展期恶性肿瘤疗效可观，且耐受性良好[6]。

本研究采用免疫组化方法检测NPC组织中PD-1的表达，分析探讨其与NPC患者临床病理特征。通过药物阻断PD-1检查点，利用彩色多普勒超声检查技术对放疗前、后NPC颈部淋巴结转移灶进行监测，探讨PD-1在NPC治疗中的意义及单克隆抗体在放射治疗NPC中起到的作用。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料来源

共收集 178例从2013年7月～2018年7月在我院经鼻咽镜活检和福尔马林固定石蜡包埋组织病理确诊为NPC并且超声检查发现颈部淋巴结的NPC患者。其中男104例，女74例，年龄25～73岁，平均（44.7±16.5）岁，淋巴结共计 293 枚。所有病例均是伴有颈部淋巴结转移灶且经病理证实的NPC患者[7]，首选治疗方案为放射治疗且治疗前没有接受其他任何治疗。本研究整理的患者基本资料包括性别、年龄、吸烟史、病理类型、分期、淋巴结转移。分期参照美国癌症联合委员会NPC TNM 分期系统（2010 年第7版），NPC组织标本病理类型均为有分化型或未分化型的非角化性癌[8]。

1.2 方法

1.2.1临床实验分组  分别将PD-1阳性和PD-1阴性患者均衡分为实验组和对照组。普通放疗组（对照组）采用60Co 射线体外照射，靶区体外照射适用于原发灶及颈部淋巴结转移灶，剂量为每次DT1.8～2.0 Gy;频率为每日照射1次，每周照射5次;总剂量限定在70 Gy[7]。实验组在对照组基础上每周静脉注射抗PD-1单克隆抗体（BMS-936559，1 mg/kg），分别于治疗前及治疗4周后接受颈部淋巴结彩色多普勒超声检查。本研究经过我院临床实验伦理委员会批准。

1.2.2 免疫组织化学染色  （1）组织处理方法：用福尔马林和石蜡固定包埋后切片、脱蜡、水化、阻断和修复处理后，加PD-1一抗，室温下孵育60 min，再加即用型MaxVision试剂，DAB显色后苏木素复染[9]。（2）免疫组织化学评分标准：在光镜下（×400）100个视野计数，每个视野计数 100 个细胞。根据阳性细胞百分比和阳性细胞染色强弱两个方面进行半定量分析，染色强度分为无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色，当阳性细胞百分比不为0，且染色强度在淡黄色或更深时视为PD-1表达阳性。

1.2.3 超声检测方法  （1）超声观察：将浅表器官定为预设条件，探头频率为7.5～10 MHz，患者充分暴露检查部位，按顺序检查双侧颈部，检查淋巴结转移灶的各个超声参数（包括具体位置、数目、形状等），同侧颈部测量最大淋巴结转移灶，测量淋巴结最大切面的参数通过脉冲多普勒测量长径（L）、短径（S）和长径/短径（L/S）。血流参数包括收缩期峰值流速（PSV）和阻力指数（RI）。（2）彩色多普勒血流显像（CDFI）观察血流分级情况：将血流强度设定为0～Ⅲ级。信号由弱到强的设定标准为：无血流信号（0级），淋巴结内探及星点状或短棒状闪烁之血流信号（Ⅰ级），淋巴结内探及1～2条棒状或条状血流信号（Ⅱ级），淋巴结探及多条条状或环状、网状血流信号（Ⅲ级）。

1.3 统计学方法

使用SPSS 19.0统计学软件对结果进行分析。计数资料采用χ2检验，计量资料经检验均属于正态分布资料，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1免疫染色结果

178例NPC患者的组织中PD-1的表达阳性率为30.3%（54/178），PD-1阴性未见棕黄色或棕褐色颗粒（封三图1a），PD-1阳性颗粒主要在肿瘤组织间质中T淋巴细胞细胞浆中（封三图1b）。结果显示，患者年龄、性别、病理类型、分期及淋巴结转移与NPC组织中PD-1的表达无关，吸烟可能与PD-1的表达有关（P<0.05），见表1。

2.2 放疗前、后实验组和对照组NPC患者颈部淋巴结转移灶超声检查情况

经病理及手术证实，178例NPC患者有293个颈部淋巴结转移灶，其中PD-1阳性患者92个颈部淋巴结转移灶，PD-1阴性患者201个颈部淋巴结转移灶。淋巴结转移灶形状呈圆形、类圆形或不规则形。

PD-1阴性患者的实验组和对照组在放射治疗前后L、S、L/S、PSV和RI等超声指标变化明显，其中两组患者的L、S、PSV和RI指标在放疗后均呈现下降趋势，而L/S则呈现升高趋势。但是，无论是治疗前还是治疗后，两组的各项超声指标之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

PD-1阳性患者的实验组和对照组在放射治疗前后L、S、L/S、PSV和RI等超声指标变化明显，其中两组患者的L、S、PSV和RI指标在放疗后均呈现下降趋势，而L/S则呈现升高趋势。其中治疗前两组的各项超声指标之间均无显著性差异;治疗4周后实验组患者的L、S、PSV和RI指标明显低于对照组，而L/S则明显高于对照组。PD-1阳性患者的实验组各项超声指标在治疗4周后较对照组变化程度明显增加。见表3。

2.3 NPC颈部淋巴结转移灶放疗前、后彩色多普勒血流显像检查情况

PD-1阳性对照组患者放疗前后淋巴结转移灶数目是45 个，治疗前血流分级0级占4.4%（2/45），Ⅰ级占20.0%（9/45），Ⅱ级占42.2%（19/45），Ⅲ级占33.3%（15/45）。放疗4周后，血流分级0级占68.9%（31/45），Ⅰ级占22.2%（10/45），Ⅱ级占8.9%（4/45），Ⅲ级占0%（0/45）。随着放疗程度的加深，淋巴结转移灶的血流强度是有显著变化的，放疗前的血流强度分布是趋于Ⅰ～Ⅲ级，放疗4周后的血流强度分布是趋于0、Ⅰ级。说明随着放疗程度的逐步加深，血流强度是趋于减弱的，见表4。

PD-1阳性实验组患者放疗前后淋巴结转移灶数目是47个，治疗前血流分级0级占4.3%（2/47），Ⅰ级占21.3%（10/47），Ⅱ级占36.2%（17/47），Ⅲ级占38.3%（18/47）。放疗4周后，血流分级0级占74.5%（35/45），Ⅰ级占21.3%（10/47），Ⅱ级占4.3%（2/47），Ⅲ级占0（0/47）。放疗前的血流强度分布是趋于Ⅰ～Ⅲ级，放疗4周后的血流强度分布是趋于0、Ⅰ级。说明随着放疗程度的逐步加深，血流强度是趋于减弱的，见表5。PD-1阳性的实验组在治疗之前淋巴结转移灶各血流分级数目基本均衡，在治疗后实验组0级较对照组比例高，而Ⅱ级较对照组比例小。

3 讨论

NPC是我国高发的恶性肿瘤之一。由于鼻咽腔的淋巴管非常丰富，所以发生颈部淋巴结转移是较为普遍的[10]。

PD-1是主要表达在 T 细胞上的一种跨膜受体，是在凋亡的 T 细胞杂交瘤中利用消减法得到的[11]。研究表明PD-1的组织表达状态是预测PD-1和PD-L1免疫治疗的重要标志物[12]，在肿瘤组织中主要表达在肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上。有研究表明，NPC患者中提高CD8+ T淋巴细胞上PD-1表达预后不良[13]。PD-1的配体已被证明有两个，分别为PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是其主要配体[14]。目前已有的研究证实，在多种实体瘤患者病灶局部及外周血免疫细胞中检测到PD-L1高表达，且高表达PD-L1的患者预后差，生存率低[15]。

有研究显示，NPC肿瘤组织中PD-1的表达阳性率为25%～35%[16]。本研究中PD-1的阳性率为30.3%，与相关研究结果相近。本研究显示PD-1的表达与年龄、性别、病理类型及分期无相关性，而是与是否吸烟相关。吸烟患者的PD-1阳性比例明显升高，有研究推测是与吸烟导致鼻咽微环境改变有关，但目前文献报道吸烟导致NPC的证据很少，仍有待进一步研究。

彩色多普勒超声检查技术是临床上检查淋巴结病变的一种常规手段。正常淋巴结的大小、形态可以作为区分良恶性的因素之一[17，18]。研究显示，超声检查中的L/S值在淋巴结良恶性鉴别中有重要意义。L/S较小时（<2.0）说明淋巴结转移灶趋于椭圆形，恶性程度高[18]。本研究结果显示，放疗4周后PD-1阴性患者的对照组和实验组的淋巴结转移灶L、S是趋于减小，L/S是趋于增大。说明经过放疗后实验组和对照组的淋巴结转移灶范围均有减小，且恶性程度减低。PD-1阳性患者的对照组和实验组的淋巴结转移灶变化趋势与PD-1阴性患者相类似，但是，PD-1阳性患者的实验组相对于对照组L、S减小和L/S增大的趋势更明显，说明抑制了PD-L1与PD-1结合可以控制NPC在淋巴结的扩散，在采用BMS-936559单克隆抗体阻断PD-1的放射治疗方案可以更有效的减小淋巴结转移灶范围，且治疗后恶性程度更低。

收缩期峰值流速（PSV）及阻力指数（RI）等相关血流参数是判断肿瘤良恶性的重要依据[19，20]。本研究结果显示，实验组和对照组的PSV和RI两项血流参数均明显降低，且PD-1阳性患者的实验组较对照组降低程度增加。说明在PD-1被阻断后，放射治療对NPC患者淋巴结转移灶的血流参数产生了影响，同样佐证了阻断PD-1可以降低NPC恶性程度的结论。

CDFI在淋巴结良恶性的鉴别中具有十分重要的临床意义[21，22]，CDFI血流分级是对于淋巴结性质进行鉴别的重要参考依据。超声诊断特征分析显示转移性淋巴结髓质和皮质边界模糊，回声逐渐减小[23]。本研究中彩色多普勒血流显像（CDFI）观察血流分级情况发现，PD-1阳性患者在放疗基础上应用BMS-936559单克隆抗体，血流分级中0级比例升高，而Ⅱ级比例减小。说明在阻断PD-1检查点起到了降低淋巴结血流强度的作用，提高了放射治疗的效果。

综上，PD-1的表达对NPC的恶性程度有较大影响，同时阻断PD-1检查点对NPC的放射治疗起到重要的作用。

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（收稿日期：2018-11-30）