甘露饮中六种有效成分提取及含量测定

黄亚 宿怀予 范秀 周荣 廖昌军

摘要：探讨甘露饮中6种有效成分（绿原酸、麦角甾苷、抽皮苷、黄琴苷、甘草酸、熊果酸）最佳提取工艺条件及含量测定方法。优化提取溶剂，通过正交试验法考察料液比、提取时间和提取次数对甘露饮提取工艺的影响。采用Syneronis C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0～5mm，5% A;5～40min，5%～20% A;40～60min，20%～50% A;60～80min，50%～90% A;80～90.1min，90%～5% A;90.1～100min，5%A），流量1.0mL/min，柱温35℃，检测波长210nm，进样量20μL的色谱条件对甘露饮提取物中6种有效成分进行含量测定。最佳提取工艺条件是：60%乙醇为提取溶剂，料液比1：4，提取时间为1h，提取次数为1次。绿原酸、麦角甾苷、抽皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸分别在4.80～80.00，10.00～100.00，24.00～400.00，30.00～500.00，6.00～100.00，3.60～60.00μg/mL浓度范围内线性关系良好（r²≥0.9995）。平均加样回收率在96.12%～101.82%，RSD在1.72%～2.92%。该提取工艺稳定可行，HPLC法能简便、准确地测定甘露饮提取物中6种有效成分的含量。

关键词：甘露饮;正交试验;绿原酸;麦角甾苷;柚皮苷;黄芩苷;高效液相色谱

中图分类号：R580 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）06-0081-07

收稿日期：2018-11-12;收到修改稿日期：2018-12-20

基金项目：德阳市科技局支撑计划（2016SZ033）

作者简介：黄亚（1988-），女，四川成都市人，主管药师，硕士，主要从事临床药学研究。

通信作者：廖昌軍（1981-），男，四川自贡市人，高级实验师，硕士，主要从事药物分析研究工作。

0 引言

甘露饮出自《太平惠民和剂局方·卷六》，由生地黄、熟地黄、麦冬、天冬、石解、积壳、茵陈、黄芩、批把叶、甘草组成，具有滋阴生津，清热解毒，祛湿和中的功效[1]，目前临床广泛用于放射性口腔炎、复发性口腔黏膜溃疡、慢性咽炎、慢性浅表性胃炎、湿热阳痿、角结膜干燥症等[2-3]。甘露饮中多种成分相辅相成、协同作用是其药理作用的重要基础，而各种潜在活性成分的含量与临床治疗效果密切相关。绿原酸是茵陈的有效成分之一，具有清除体内自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒和保肝利胆等作用[47。麦角甾苷是地黄中苯乙醇苷类成分的代表。柚皮苷为积壳中黄酮类成分之一，具有抗氧化、抗变态反应、抑制胃肠道平滑肌作用[5]。黄芩苷是黄芩的指标性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌等药理作用[6-7]。甘草酸是甘草中最主要的活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用[8]。熊果酸是批把叶中有效成分，具有保肝、消炎、抗肿瘤、调血脂、免疫双向调解等药理作用。在国内外研究中分别关于绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸的含量提取及测定方法有相关报道[9-15]，而甘露饮中多种代表性活性成分的提取及同时定量，国内外尚未见文献报道。因此，本实验采用了正交试验法，以6种有效成分绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸的含量为指标，对甘露饮的提取工艺进行研究，优选出最佳提取工艺，同时建立了HPLC法测定6种有效成分的含量，为完善甘露饮质量评价标准和临床用药提供依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）;烘箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;XW-80A型旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）;旋转蒸发仪（德国IKA）;CP225D型电子天平（德国赛多利斯公司）;粉碎机（吉首市中诚制药机械厂）。

1.2 材料

每批甘露饮处方药材包括生地黄15g、熟地黄15g、麦冬15g、天冬15g、石斛15g、积壳10g、茵陈10g、黄芩10g、批把叶10g、甘草6g（均购自四川博仁药业有限公司，批号分别为171001，180201，180401，180301，171001，180101，180401，180302，180301，180201，均符合2010年版《中国药典））和《卫生部药品标准》有关规定）;绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸对照品（成都植标化纯生物技术有限公司，批号分别为180302，180213，180119，180221，180105，180626，纯度均≥99%）;甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher），磷酸为色谱纯（成都市科隆化学试剂有限公司），乙醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Syncronis C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.1磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0～5min，5% A;5～40min，5%～20% A;40～60min，20%～50% A;60～80min，50%～90% A;80～90.1min，90%～5% A：90.1～100min，5%A），流量1.0mL/min，柱温35℃，检测波长210nm，进样量20μL。

2.2 混合对照品溶液制备

精密称取绿原酸对照品5.0mg，麦角甾苷对照品5.0mg，柚皮苷对照品40.0mg，甘草酸对照品10.0mg，用70%乙腈定容至10mL。精密称取黄芩苷对照品10.0mg，熊果酸对照品5.0mg，用甲醇定容至5mL量瓶中，作为单个对照品贮备液，分别吸取上述6种单个对照品贮备液1.6，2.0，1.0，2.5，1.0，1.2mL于10mL量瓶中，70%乙腈定容至刻度，即得绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸（质量浓度分别为80，100，400，500，100，60μg·mL^-1）混合对照品贮备液，冷藏备用。

2.3 供试品溶液制备

按处方量称取相应量的甘露饮中药材，粉碎过10目筛。称取甘露饮粗粉，用60%乙醇提取，料液比1：4，提取时间为1h，提取次数为1次，旋转蒸发仪浓缩至粘稠状后，烘干得浸膏。精密称取浸膏0.1g，加入70%乙腈定容至10mL，即得。

2.4 系统适应性实验

分别取混合对照品溶液和供试品溶液按2.1项下色谱条件测定，结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸及熊果酸的保留时间分别为14.2，25.8，27.8，32.7，51.3，74.7min，供试品中其他成分不干扰样品测定，如图1所示。

2.5 线性关系考察

精密吸取2.2项混合对照品贮备液0.3，0.75，1.5，3，4mL定容至5n正量瓶中，70%乙腈稀释至刻度，即得系列浓度的对照品溶液，取混合对照品贮备液和系列浓度的对照品溶液按2.1项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，绘制标准曲线，结果见表1，可知6种有效成分在一定质量浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度实验

精密吸取2.2项混合对照品溶液4n止至5 mL量瓶中，70%乙腈定容至刻度，按2.1项下色潜条件连续进样5次，结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.67%，2.89%，0.18%，0.21%，0.33%，1.19%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验

按处方量称取相应量的甘露饮中药材，按2.3项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0，3，6，9，12，24 h测定，结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸峰面积的RSD分别为3.00%，2.87%，1.60%，0.84%，3.23%，0.98%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8 重复性实验

按处方量称取相应量的甘露饮中药材，共6份，按2.3项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.89%，2.67%，1.08%，0.24%，2.64%，3.01%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收试验

精密称取甘露饮浸膏0.05g，共9份，分别置于9个5mL量瓶中，用70%乙腈定容，分别按已知含有量的80%、100%、120%3个水平加入混合对照品溶液，每个水平3份，按2_1项下色谱条件测定，计算回收率，见表2。结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄琴苷、甘草酸、熊果酸的加样回收率平均值在96.12%～101.82%，RSD在1.72%～2.92%。表明该方法回收率良好。

2.10 甘露饮提取工艺优化

2.10.1 提取溶剂的选择

按处方量称取相应量的甘露饮中药材，粉碎过10目筛。称取甘露饮粗粉，分别采用纯水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各500mL，连续提取2次，每次2h，提取液旋转蒸发浓缩后喷雾干燥。分别取干燥后粉末0.1g，加入70%乙腈定容至10mL，按2.1项色谱条件分别测定干粉中绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸含量。结果表明60%乙醇为提取溶剂所得干粉中六种有效成分含量均较高，本试验选择60%乙醇作为提取溶剂，进行正交试验优化工艺研究。

2.10.2 正交试验设计

根据前期预实验结果，选择料液比、提取时间、提取次数为影响因素，实验因素水平见表30每个因素选择3个水平进行L₉（3⁴）正交试验设计，以甘露饮中绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸的提取率作为评价指标，按2.1项下色谱条件测定提取干燥后样品中6种有效成分峰面积，计算提取率，实验设计方案与结果见表4，方差分析见表5。提取率=样品峰面积际准品峰面积×100%。

由表4可知序号1效果最优，得到最优条件是料液比1：4、提取时间1h、提取次数1次。方差分析结果表明提取时间对熊果酸、甘草酸、柚皮苷、绿原酸的提取含量影响显著;黄芩苷的提取含量受料液比、提取时间、提取次数的影响相当;提取时间、提取次数对麦角甾苷的提取含量影响不显著。料液比、提取时间对甘草酸的提取含量有显著影响：料液比1：8、提取时间为1h得到甘草酸含量最多，即序号4为最优;提取次数对绿原酸含量有显著影响：提取次数为1次，绿原酸含量最多，即第3因素下1水平为最优方法。液料比、提取时间、提取次数对熊果酸、黄芩苷、抽皮苷、麦角甾苷提取含量影响并不显著。

综合以上实验结果，最佳提取工艺条件是：甘露饮提取溶剂为60%乙醇，料液比1：4、提取时间为1h，提取次数为1次。

2.10.3 验证试验

根据正交实验筛选出来的最佳提取工艺制备3批喷雾干燥供试品，按2.1项下色谱条件进行测定，结果3批供试品中绿原酸平均含量为8.56μg/g（RSD=2.52%）;麦角甾苷平均含量为16.85μg/g（RSD=2.88%）;黄芩苷平均含量为266.46μg/g（RSD=2.65%）;柚皮苷平均含量为173.86μg/g（RSD=2.08%），甘草酸平均含量为14.33μg/g（RSD=2.52%），熊果酸平均含量为14.85μg/g（RSD=3.00%）。6种有效成分含量RSD均在3%以内，表明工艺稳定可行。

3 结束语

试验考察了甲醇、乙腈、缓冲盐种类和浓度对样品分离的影响，最后确认乙腈和0.1磷酸溶液进行梯度洗脱后，各色谱峰分离度好，保留时间适中，基线稳定，绿原酸、黄芩苷、甘草酸和熊果酸峰型和分离度均较好，而麦角甾苷與柚皮苷由于自身化学性质和方剂中含量差异的影响，能实现基线分离。经过方法学考察试验，本文建立的含量检测方法准确、可靠，重复性好，可用于同时测定甘露饮中多种物质的含量，为甘露饮质量控制及综合评价提供了借鉴。

参考文献

[1]宋.太平惠民和剂局编.太平惠民和剂局方[M].北京：人民卫生出版社，1985：308.

[2]路军章，张蕾.中医药防治急性放射性食管炎[J].中华中医药杂志，2012，27（12）：3019-3022.

[3]罗素芳.甘露饮加减在阴虚湿热证型角结膜干燥症治疗中的疗效观察[J].中医临床研究，2017，9（32）：113-114.

[4]严永旺，肖兰，周旭，等.绿原酸的药理作用及药用研发对策[J].中国药房，2017，28（19）：2729-2732.

[5]金元宝，刘萍，刘小根，等.柚皮苷的生物活性研究进展[J].中国现代医药杂志，2018，20（3）：92-97.

[6]XU L，LI J，ZHANG Y，et al.Regulatory effect of baicalin onthe imbalance of Th17 /Treg responses in mice with allergicasthma[J].Journal of Ethnopharmacology，2017，208：199-206.

[7]周红潮，杜锐，王慧，等.黄苘蒸药代动力学研究进展[J].中国中药杂志，2018，43（4）：684-688.

[8]万嘉洋，张宇燕，黄平，等.甘草中甘草酸的粗提工艺研究[J].中华中医药学刊，2017，35（1）：149-151.

[9]王韵，赵亮，柴逸峰，等.RP-HPLC法同时测定茵陈篙汤中14个成分[J].药物分析杂志，2017，37（3）：393-401.

[10]林鹏.RP-HPLC法同时测定生地黄中麦角甾苷和马替诺皂苷的含量[J].医学影像与检验，2017，4（14）：273.

[11]邓桂珠，蓝文煜，窦佩丹，等.积壳及其炮制品色差值与化学成分的相关性[J].中成药，2017，39（6）：1228-1231.

[12]于东平.甘露饮合剂的制备与质量控制[J].中国中医药咨询，2011，3（15）：375-376.

[13]夏雪，王溪晓，任国庆，等.26批不同来源积壳中成分柚皮苷与橙皮苷及新橙皮苷含量分析[J].亚太传统医药，2018，14（6）：58-60.

[14]刘慧妍，黄馨慧，张艳海.HPLC法快速测定8种中药中齐墩果酸和熊果酸[J].中草药，2017，48（10）：1998-2001.

[15]周倩，戴衍朋，王亮，等.HPLC法测定生甘草、炙甘草中6种成分[J].中成藥，2016，38（2）：378-382.

（编辑：徐柳）