台州地区汉族哮喘人群5-HTT 基因Stin2 位点多态性分析与抑郁易感性研究

林 玲 徐友文 徐佳佳 裴 璐 吕冬青

支气管哮喘（简称哮喘）是气道慢性炎症疾病，也是具有多基因遗传倾向的疾病。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）作为一种广泛存在的抑制性神经递质，参与情绪神经活动的调节，与抑郁发生密切相关，亦是哮喘神经因素发生机制的重要组成部分。5-HTT 的第二内含子可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多态性即Stin2 位点的多态性已被证实是与抑郁发病相关的功能位点[1]。本研究探讨5-HTT 基因多态性，检测Stin2 多态位点，分析其与哮喘发生及哮喘患者合并抑郁的相关性，有助于深入了解该基因在哮喘发病机制中的意义。

1 临床资料

1.1 研究对象 选取2017 年7 月—2018 年7 月在浙江省台州医院呼吸内科住院及门诊治疗的台州地区汉族哮喘患者204 例，其中女99 例，男105 例，平均年龄43.2 岁，为哮喘组，汉族健康志愿者200 名，其中男100 名，女100 名，平均年龄41.4 岁，为对照组。本研究经伦理委员会批准审核通过。所有研究对象均签署知情同意书，相互无血缘性关系。

1.2 入选、排除标准 哮喘组入选标准：（1）按中华医学会2016 年支气管哮喘防治指南[2]，确诊为哮喘患者；（2）年龄＞18 岁；（3）既往1 年内曾行支气管激发试验阳性或支气管舒张试验阳性，入组时处于哮喘慢性持续期；（4）长期生活在浙江台州，三代均为汉族，家族内未与其他民族通婚。排除标准：（1）哮喘急性发作期；（2）难治性哮喘；（3）合并严重肝、肾、心脏等原发性疾病；（4）曾有精神性疾病。对照组入选标准：（1）年龄＞18 岁的健康人群；（2）长期生活在浙江台州，三代均为汉族，家族内未与其他民族通婚；（3）近1 个月内无急性上呼吸道感染；（4）近1 年内肺部X 线检查未见异常。排除标准：（1）过敏性疾病史；（2）个人及家族哮喘病史；（3）合并精神性疾病；（4）合并严重肝、肾、心脏等原发性疾病；（5）全身免疫性疾病；（6）合并支气管扩张、间质性肺病、肺癌等肺部疾病。

2 方 法

2.1 研究方法 签署自愿签署知情同意书后，以问卷调查形式，让被研究者填写抑郁自评量表（SDS）[3]，以评估被研究者生存质量及抑郁情绪。根据调查结果将调查对象分为抑郁组和非抑郁组。（1）自设问卷调查：获取调查对象临床特征和基本人口学资料。（2）抑郁自评量表（SDS）：由20 个指标构成，SDS 标准分/80X100%为抑郁指数，70%以上为重度抑郁；60%～69%为中至重度抑郁；50%～59%为轻微至轻度抑郁；50%以下者为无抑郁。

2.2 检测指标及方法

2.2.1 仪器及试剂 美国ABI 公司2720 型实时荧光定量PCR 仪；美国ABI 公司3730XL 型DNA 测序仪；人全血基因组DNA 提取试剂盒、基因分型试剂盒均购自Takara 公司。

2.2.2 基因组DNA 提取 抽取研究对象外周静脉血2mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管，使用Takara 公司人全血基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，于-70℃冰箱保存待使用。

2.2.3 引物设计与合成 通过NCBI 查询5-HTT 基因Stin2 位点的全长序列，使用网页Primer 3.0 设计引物，Stin2 的上下游引物分别为5’-GTCAGTATCACAGGCTGCGAG-3’和5’-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3’。引物由苏州贝斯派生物科技有限公司合成。

2.2.4 PCR 扩增 采用qRT-PCR 方法对Stin2 基因多态性进行检测。Stin2 扩增条件：95℃3min，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35 个循环，最后以72℃延伸10min。取5-HTT 基因Stin2 扩增产物在琼脂糖凝胶进行100V 电泳30～40min，取出凝胶板放置于紫外灯下观察，使用全自动凝胶数码成像及分析系统进行目的基因片段分析扩增。使用琼脂糖凝胶电泳的形式对扩增的PCR 产物进行切胶回收的方式纯化。对胶回收的PCR 产物进行定量（点胶或测260/280），按照测序SOP 所标注的测序反应的方案来安排测序PCR 反应，然后对测序PCR 的样品进行磁珠纯化。在DNA 测序仪上机测序。与目的序列进行分析比对，对SNP 位点进行分析。

2.3 统计学方法 计量资料进行方差齐性检验，方差齐性采用χ2检验统计分析。各等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。采用行—列表卡方检验方法对基因型和等位基因频率进行两两差异比较。使用Upphase 软件分析单倍型，其他资料采用SPSS 18.0 软件分析。用卡方检验分析5-HTT 基因Stin2 位点与哮喘及哮喘发生抑郁的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Hardy-Weinberg 平衡检验结果 对照组、哮喘组的Stin2 基因达到遗传平衡，具有代表意义。Stin2出现3 种基因型Stin2.10/Stin2.10（267bp），Stin2.10/Stin2.12（267bp，301bp），Stin2.12/Stin2.12（301bp）。哮喘组Stin2.12/12 基因型频率71.6%，对照组频率82.5%，差异有统计学意义（P=0.009）。哮喘组Stin2.10/12 基因型频率25.5%，对照组频率16.50%，差异有统计学意义（P=0.027）。Stin2.12、Stin2.10 等位基因频率在哮喘组差异有统计学意义（χ2=7.650，P=0.006）。见表1-2、图1。

表1 哮喘组与对照组Stin2 位点基因频率比[例（%）]

表2 哮喘组与对照组Stin2 等位基因频率比[例（%）]

3.2 哮喘患者与对照组合并抑郁情况 哮喘患者并发抑郁者88 例，发生率43.1%（88/204），其中重度抑郁16 例，占7.8%（16/204）；中度抑郁28 例，占13.7%（28/204）；轻度抑郁44 例，占21.5%（44/204）。对照组并发抑郁者34 例发生率17%（34/200），其中重度抑郁4 例，占2%（4/200）；中度抑郁12 例，占6%（12/200）；轻度抑郁18 例，占9%（18/200）。哮喘组抑郁发生率显著高于对照组（χ2=32.73，P＜0.05），见表3。

图1 Stin2 测序图谱

表3 哮喘组与对照组发生抑郁情况的比较[例（%）]

3.3 哮喘组Stin2 不同基因型及等位基因频率与抑郁发生情况的比较 哮喘组中发生抑郁的Stin2.12/12 基因型频率为81.8%，非抑郁频率为63.8%，差异有统计学意义（P=0.005）。哮喘组中发生抑郁的Stin2.10/12 基因型频率为14.7%，非抑郁频率为33.6%，差异有统计学意义（P=0.001）。哮喘组Stin2基因的12、10 等位基因在抑郁组和非抑郁组表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4-5。

表4 哮喘组Stin2 不同基因型频率与抑郁发生情况比较[例（%）]

表5 哮喘组Stin2 不同等位基因频率与抑郁发生情况比较[例（%）]

4 讨论

5-HT 是体内重要的神经递质成分，同时也是机体内的免疫调节剂，其广泛存在于嗜碱性粒细胞、肥大细胞和血小板等细胞中，在变态反应炎症过程中介导一系列的细胞免疫反应，包括细胞迁移、细胞吞噬、分泌细胞因子等[4]。5-HT 可通过抑制白介素-12活性并促进肺泡巨噬细胞分泌前列腺素-2 来调节肺内细胞因子网络而发挥作用，以化学引诱物形式促进嗜酸细胞的迁移和交换来引起哮喘发作[5]。国外学者发现，在哮喘患者中有27%合并抑郁，高于正常人群[6]。5-HT 受5-羟色胺转运体（5-HTT）的调控，多项研究已发现5-HTT 基因Stin2 多态性可能与哮喘的发病相关。5-HTT 基因的功能多态性位点包含第二内含子可变数目串联重复序列（VNTR Stin2）。目前国内外研究发现，5-HTT 基因多态性与多种疾病相关，其中与抑郁、慢性阻塞性肺病、骨质疏松症、肥胖疾病相关性已有多项报道并且有区域及种族差异，表明5-HTT 基因的多态性位点可能具有复制的生物学作用，需进一步的探索其具体生物学功能以促进研究[7-10]。

研究发现，5-HTT 基因多态性在健康组，哮喘组和无焦虑组，以及哮喘和焦虑组中的分布有显着差异，同时5-HTT 的表达增加了哮喘患者发生焦虑的风险[11]。本研究结果显示，台州地区汉族哮喘患者中43.1%发生抑郁，远高于健康对照组的17%。Stin2.10/Stin2.12、Stin2.12/Stin2.12 基因型频率在哮喘组和正常对照组中构成比存在显著性差异，Stin2.10 等位基因频率在哮喘组中较对照组增高，提示该等位基因携带者可能为发生哮喘易感因素。王岚等[12]研究发现Stin2 多态性的等位基因和基因型频率在男性健康组和男性哮喘组之间存在差异，在男性哮喘组中Stin2.12/Stin2.10 基因型和Stin2.10 等位基因型所占比例高于健康对照组，含有Stin2.10等位基因型或Stin2.12/Stin2.10 基因型的男性发生哮喘的风险分别增高1.9 倍和2.3 倍。这提示存在5-HTT 基因Stin2.12/Stin2.10 基因型和Stin2.10 等位基因型人群发生哮喘风险增加，且可能与性别相关，有待于进一步扩大样本研究。国外研究发现，Stin2.12等位基因与烟草暴露合并和情绪障碍呈正相关，可引起情绪障碍，抑郁或双相抑郁[1]。本研究显示，哮喘合并抑郁组Stin2.10/Stin2.12、Stin2.12/Stin2.12 基因频率和哮喘非抑郁组的表达具有显著性差异。哮喘组Stin2 基因的12、10 等位基因表达在抑郁组和非抑郁组差异有统计学意义（P＜0.05），Stin2 基因的12等位基因表达在抑郁组高于非抑郁组，提示哮喘Stin2.12 等位基因携带者为抑郁发生易感因素。

本研究结果显示，5-HTT 基因中Stin2 基因多态性与台州地区汉族人群发生哮喘呈显著相关。在哮喘人群中Stin2.12 等位基因携带者为抑郁发生易感因素，可能与哮喘伴发抑郁易感性有关。但基于本研究样本不够全面，存在一定的区域局限性，有必要在今后的研究中进一步扩大样本量。