树突状细胞/肺癌细胞杂交疫苗特异性抗肺癌免疫作用研究

刘 锐，刘 蕾，赵丽纯，刘子维，高媛媛，白 冰

(1.吉林大学中日联谊医院 a内分泌科;b医务部;c感染管理部,吉林 长春130033；2.吉林大学药学院 生物工程教研室)

树突状细胞(DC)被确定为最有效的抗原递呈细胞(APC)，操纵和刺激免疫系统的关键组成部分。DC通过促进肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CLT)和辅助性T细胞(Th细胞)的产生和增殖，在诱导保护性和治疗性抗肿瘤免疫中发挥着关键作用[1]。研究者已经报道过许多肿瘤抗原(Ag)负载DC诱导高效抗肿瘤免疫反应，在小鼠肿瘤模型和肿瘤患者试验中均有[2]。最佳治疗参数包括DC来源、DC成熟、抗原选择(Ags)、Ag载体方法、注射部位、剂量和适当的抗肿瘤免疫监测，这些方法的疗效需进一步提高。治疗参数包括DC来源、DC成熟、抗原选择(Ags)、Ag载体方法、注射部位、剂量和适当的抗肿瘤免疫监测，这些方法的疗效需进一步提高，因此以其为基础设计的肿瘤疫苗日益受到重视[3,4]。然而，目前树突状细胞/肿瘤细胞杂交疫苗在肺癌中的功能及其免疫机制少见报道，因此本项研究探索其特异性抗肺癌免疫作用，可以为恶性肿瘤的治疗和判断预后提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

骨髓：共10例,骨髓病理检查诊断骨髓内均无癌灶，无病理骨髓象。获自吉林大学第三临床医院胸外科肺癌患者手术中切下的肋骨；肺癌组织标本：共10例，取自上述患者手术中切下的肿瘤样本，均经病理检查确诊为肺癌，保存于液氮中。外周血：上述10例患者的外周血。患者术前未接受放疗、化疗，均签署知情同意书。本研究经吉林大学第三临床医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器

试剂：RPMI-1640培养基，L-谷氨酰胺青霉素、链霉素，新生胎牛血清，FITC标记抗CD86，抗组织相容性抗原-DR抗体，抗CA-199单克隆抗体，淋巴细胞分离液， 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)，重组人白介素- 4(rhIL-4)，聚乙二醇-4000(PEG-4000)，氚-胸腺嘧啶核苷，丝裂霉素胰蛋白酶。

主要仪器设备：二氧化碳孵箱(日本)，倒置显微镜(日本)，生物安全柜(国产)，-80℃低温冰箱(日本)，超速离心机(国产)，酶标仪(美国)，流式细胞仪(美国)，γ照射源(法国)。

1.3 主要方法

1.3.1从肋骨髓中提取骨髓全血细胞 体外诱导：无菌操作下，取肋骨，用PBS冲洗，再用骨钳切成4 cm左右长，在一侧用已吸取RPMI-1640培养基的注射器，清洗骨髓腔，冲洗多次后，100 mm尼龙细胞过滤器过滤，淋巴细胞分离液(70%)分离单核细胞。获得的单含细胞配置成 1×106cells/ml 浓度，被添加到含RPMI 1640完全培养基的24孔培养皿中，并补充补10 ng/ml rhGM-CSF及20 ng/ml rhIL-4以诱导单核细胞在体外分化成DC，在37℃,5% CO2，加湿的培养箱中孵育。

1.3.2DC表型检测 抗体CD86、HLA-DR作免疫荧光染色及流式细胞荧光分选技术分析培养9天的DC。

1.3.3癌细胞培养 液氮中取出10例肺癌样本，无菌剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化组织5 h后，收集单个细胞，PBS冲洗，培养于RPMI 1640完全培养基中；通过组织学染色观察肿瘤细胞形态。

1.3.4DC与肺癌细胞杂交及鉴定 DC与肺癌原代细胞通过50%PEC-4000融合杂交，DC与癌细胞的比例为2:1，融合细胞培养在含20%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中,培养体系中加入 GM-CSF(4 ng/ml)。测定CD86、HLA-DR表达水平，FICT-抗HLA-DR、CD86抗体标记DC。取一株DC/肿瘤细胞融合细胞、且CA199阳性表达的细胞，以FICT-抗CD86和PE-抗CA199进行双标记，同时以肿瘤细胞和DC作为对照组，检测DC/肿瘤细胞杂交体的免疫反应。

1.3.5CTL产生及测量其活性 分组如下：DC单独(1.5×106/鼠)、肿瘤细胞单独(4×105/鼠)、DC与肿瘤细胞同时加入、抗原肽刺激DC、DC/肿瘤细胞融合瘤苗后，以20 000 rad剂量照射上述细胞后，与同源外周血单核细胞共同培养3天，再与肺癌细胞共同培养5天，掺入3H-TdR 20 h后，收集细胞，测定放射性核素闪烁记数值。

2 结果

2.1 DC的产生

我们以骨髓前体细胞为原料制备DC。镜下观察，在培养的前5天，并没有明显的细胞集聚体出现，而在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养4天，树突状细胞集聚体出现，收货典型的成熟DC，见图1。

2.2 人骨髓DC及融合细胞的表型特征

体外诱导的人骨髓来源DC表达高水平表达HLA-DR、CD86。对照组DC和肿瘤细胞表达一种相应抗原，而杂交体同时高表达两种抗原，见图2、图3。

图1 人骨髓来源的DC的形态学观察(200×)

图2 人骨髓来源的DC表型特征

图3 骨髓来源的DC/肿瘤融合细胞的表型特征

2.3 原代培养肺癌细胞的形态结构特征

如图4所示，6例原代培养肺癌细胞均呈上皮型，细胞形态多样，多呈多角型，核：浆比例增加，核深染。

图4 原代培养肺癌细胞(瑞氏染色)

2.4 DC/肺癌杂交体对CTL的诱导

见表1。在体外，DC/肺癌细胞杂交疫苗能有效诱导CTL产生，后者对靶细胞产生显著的杀伤效力；以抗原肽刺激DC、DC/肺癌细胞杂交体同时加入诱导CTL的培养体系，均可诱导出CTL活性，但是抗原肽刺激DC对靶细胞的细胞毒效力明显低于杂交瘤苗。

表1 人DC融合疫苗的体外诱导杀伤作用

注：**第4组、第5组分别与前3组比较；***第6组与前3组比较；*第6组与第4、第5组比较

3 讨论

应用癌症免疫疗法治疗癌症患者是一个很有前景的临床研究领域。DC作为一种专业的抗原呈递细胞(APCs)，在诱导抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。因此，基于DC的癌症免疫治疗成为研究的热点[5,6]。以肿瘤细胞基因转染DC、肿瘤裂解物的脉冲DC、肿瘤抗原致敏等,是目前主要的疫苗制作方发。但这些方法具有免疫应达应有限、半衰期短、组织相容性复合体(MHC)分子的已知抗原多肽数量有限等缺点；因此，开发新的肿瘤治疗方法收到广泛关注。目前正在研究一种利用通过化学、电、物理手段或病毒产生的使DC和整个肿瘤细胞生成杂交融合细胞。与上述方法相比，融合方法为抗原肽的表达和随后诱导抗肿瘤免疫反应提供了若干优势。DC-肿瘤融合细胞可以避免识别单个肿瘤相关抗原(TAA)的艰巨任务。此外，DC-肿瘤融合细胞可呈递多种TAA，包括未鉴定的分子，从而增加响应抗原特异性T细胞的频率和使抗肿瘤免疫力最大化。重要的是，DC-肿瘤融合细胞可以在丰富的共刺激分子的情况下通过MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子呈递抗原肽，从而同时激活多克隆抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，提供T细胞帮助并避免诱导耐受。DCs以及肿瘤细胞被独立修饰，而它们的特征在融合后持续存在。

许多动物研究表明，DC-肿瘤融合细胞疫苗不仅可以提供针对肿瘤细胞攻击的保护作用，还可以消退已建立的肿瘤，包括结肠直肠癌，食道癌，胰腺癌，肝细胞癌，乳腺癌，喉癌，肾细胞癌，肉瘤，肥大细胞瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤和骨髓瘤[7,8]。目前，树突状细胞/肿瘤细胞杂交疫苗在肺癌中的功能及其免疫机制未见报道。此外，许多佐剂包括白细胞介素-2(IL-2)，IL-12，IL-18，Toll样受体(TLR)和合成的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)已被用于增强抗肿瘤免疫力[9]。

本研究结果表明，在体外DC/肺癌细胞杂交体能够有效刺激T淋巴细胞，并诱导有效的抗肿瘤T细胞应答。其淋巴细胞毒性显著高于以抗原肽刺激DC所诱导产生。因此，DC/肺癌细胞杂交体可能对治疗肺癌有价值。但是，当DC-肿瘤融合细胞疫苗用作癌症免疫疗法时，佐剂对于诱导抗肿瘤免疫是必需的，从而为癌症患者提供强大的临床益处。

尽管本实验DC杂交瘤苗对肺癌细胞的治疗效果的研究取得一定进展,未来仍需要动物实验和体内深入验证，并进一步探索DC杂技瘤苗抗肺癌免疫应答及其机制。由于 DC与肿瘤细胞杂交体后递呈的抗原较为复杂,应用于机体可能引起人体面的其他变异，因此在未来的实验中需对融合方法的安全性、临床局限性、抗肿瘤干细胞反应的程度、副作用等方面进一步探索。