藤黄酸衍生物的合成及其抗肿瘤活性

姜 毅，易春蝶，张丹妮，尹俊林，曾广智，樊保敏

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500；2 云南民族大学 化学与环境学院，云南 昆明 650500)

自进入21世纪以来，癌症日趋成为人类健康的最大威胁之一，也成为众多医药学家研究的焦点[1].在早期，以顺铂，环磷酰胺等为代表的细胞毒性药物曾经是癌症患者的首选药物.之后以紫杉醇[2-3]为代表的天然产物药物也成为了众多患者的福音.藤黄酸作为从我国传统中药藤黄中分离出的有效成分，以其良好的抗癌活性与广阔的发展前景受到众多研究人员的关注.

藤黄酸(gambogic acid，GA)是一种具有独特桥环呫吨酮骨架的天然化合物(见图1)，提取自藤黄科植物藤黄树分泌的树脂(中药藤黄)[4].研究表明其具有优秀的抗癌活性[5-6]，可以通过诱导肿瘤细胞凋亡[7]、抑制肿瘤细胞增殖[8]、诱导分化[9]和抗肿瘤转移[10]等作用达到抗癌的效果.藤黄酸在发挥抗癌活性的同时，对于造血系统和白细胞的影响较小.为了克服藤黄酸水溶性差，血管刺激强，稳定性差等缺点，研究人员对其进行了多种结构修饰.Zhang等[11]的研究表明9-位，10-位的双键是藤黄酸的关键活性基团，对于诱导肿瘤细胞凋亡的活性具有重要作用；对30-羧基与6-酚羟基的酯化和酰胺化等改造基本不影响藤黄酸的肿瘤细胞毒活性，在30-位引入某些基团反而会提高活性.Wang等[12]对GA 衍生物的研究中发现，针对C-35，C-39 位甲基修饰，C-32，C-33 和C-37，C-38 双键改造,可以提高GA 的抗肿瘤活性.

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，而蛋白质是人体细胞的重要组成部分，具有构建细胞，调节代谢，提供能量等作用.动物体内有20种必需氨基酸，根据其侧链性质的不同，可分为四大类：非极性氨基酸、极性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸.在药物分子中引入不同种类的氨基酸，可以改变其水溶性和代谢速率等多种特性，同时多个氨基酸相连而成的多肽还具有特异性识别等作用[13].为了得到更具发展前景的藤黄酸药物，我们对藤黄酸30位进行酰胺化，通过向其引入不同种类的氨基酸，合成得到了多个藤黄酸衍生物，并对其进行了体外抗肿瘤活性筛选，希望得到具有更好发展前景的分子.

1 研究方法

以藤黄酸为原料，将氨基酸甲酯通过酰胺化法与藤黄酸30位羧酸相连接.其中疏水性氨基酸大多数直接相连接，亲水性氨基酸先通过二氯树脂保护侧链再与藤黄酸相连，随后脱掉保护基以暴露活性侧链.合成路线见图2.试剂和反应条件分别为：(a)DMAP,EDCI,CH2Cl2,DIEA,r.t.,35%～57% (b)HBTU,Amino acid-Resin,DIEA,DMF,r.t.;(c)CH2Cl2,CF3COOH,r.t.,28%～49%.

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

BrukerAvance 400、BrukerAvanceIII HD 600型核磁共振仪(CDCl3或CD4O为溶剂)；Agilent 6420型质谱仪(ESI-MS)；Molecular Devices SpectraMax i3x型多功能酶标仪；Thermo Scientific 3425型二氧化碳培养箱.藤黄酸原料购自瑞芬思生物科技有限公司；氨基酸原料购自萨恩化学技术(上海)有限公司；保护氨基酸购自淘普生物科技有限公司.DMEM培养基、胎牛血清、谷氨酰胺购自Biological Industries公司；三(羟甲基)氨基甲烷购自生工生物工程(上海)股份有限公司；磺酰罗丹明B购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸购自萨恩化学技术(上海)有限公司；冰乙酸购自天津富宁精细化工有限公司.实验所用试剂均为分析纯.

2.2 30-甘氨酸甲酯-藤黄酸衍生物的合成

在反应管中加入 10 mL 的 CH2Cl2,然后加入 50 mg 藤黄酸以及 10 mg 甘氨酸甲酯，38.11 mg(2.5 eq)EDCl，4.8 mg(0.5 eq)DMAP，39.4 mmL (3 eq)DIEA.常温下搅拌 4 h.用 1N盐酸水溶液与 10 mL 蒸馏水分别洗涤3次.收集有机相，用无水硫酸钠干燥并旋干，硅胶柱层析用V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=90 ∶10.产物为黄色固体，产率43%.1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ∶1.28 (s,3H,19-H),1.30～1.43 (m,3H,24-H),1.45 (s,3H,40-H),1.55 (s,3H,35-H),1.69 (s,3H,29-H),1.74 (s,3H,25-H),1.80 (s,3H,34-H),1.98～2.07 (m,2H,36-H),2.28～2.35 (dd,J=4.48 Hz,J=13.44 Hz,1H,21a-H),2.54 (d,J=9.76 Hz,1H,22-H),2.66～2.75 (m,1H,32-H),2.93(d,J=32 Hz,2H,26-H),3.16～3.24 (m,1H,31b-H),3.27～3.36 (m,1H,31a-H),3.46 ～ 3.51 (m,1H,11-H),3.73 (m,3H,Gly-OMe),3.97 (s,1H,Gly-OMe),3.98 (s,1H,Gly-OMe),5.0～5.08 (m,1H,37-H),6.62 (d,J=12 Hz,1H,4-H),6.77～6.83 (m,1H,27-H),7.56 (d,J=8 Hz,1H,10-H),8.0 (s,1H,NH),12.86 (s,1H,6-OH);13C NMR (CDCl3,100 MHZ)δ:17.6 (C-34),18.1 (C-40),18.4 (C-39),21 (C-31),22.6 (C-36),25.2 (C-21),25.6 (C-35),25.7 (C-39),27.9 (C-19),28.8 (C-24),28.9 (C-25),29.9 (C-26),40.8 (C-Gly),42.2 (C-20),46.9 (C-11),48.9 (C-22),5.23 (C-Gly),58.4 (C-23),83.6 (C-2),84 (C-13),90.9 (C-14),100.39 (C-7),102.7 (C-5),107.7 (C-17),115.7 (C-4),123.6 (C-32),124.8 (C-37),126.3 (C-3),121.9 (C-28),131.8 (C-38),131.9 (C-33),133 (C-9),134 (C-10),135 (C-27),157.4 (C-16),157.6 (C-6),161.6 (C-18),170.2 (C-30),178.9 (C-8),204 (C-12);ESI-MS (m/z):700.1[M+H]+.

2.3 30-丙氨酸甲酯-藤黄酸衍生物的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率61%.1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:1.28 (s,3H,19-H),1.30～1.43(m,3H,24-H),1.30～1.43 (m,3H,Ala-H),1.45 (s,3H,40-H),1.56 (s,3H,35-H),1.64 (s,3H,39-H),1.66 (s,3H,24H),1.69 (s,3H,29-H),1.73 (s,3H,25-H),1.80 (s,3H,34-H),1.99 ～ 2.08 (m,2H,36-H),2.30 (dd,J=5.6 Hz,J=13.2 Hz,1H,21a-H),2.54(d,J=10 Hz,1H,22-H),2.75～2.85(m,1H,32-H),2.93 (d,J=31.6 Hz,2H,26-H),3.12～3.24 (m,1H,31b-H),3.25～3.36 (m,1H,31a-H),3.42～3.52 (m,1H,11-H),3.73 (m,3H,Ala-OMe),4.44～4.54 (m,1H,Ala-OMe),5.0～5.08 (m,1H,37-H),5.0～5.08 (m,1H,3-H),5.43～5.45 (m,1H,32-H),6.07 (t,1H,32-H),6.67 (d,J=12 Hz,1H,4-H),6.64～6.83 (m,1H,27-H),7.56 (d,J=8 Hz,1H,10-H),8.0 (s,1H,NH),12.89 (s,1H,6-OH);13C NMR (CDCl3,100 MHZ)δ:17.6 (C-34),17.7 (C-Ala),18.1 (C-40),21 (C-31),22.6 (C-36),25.6 (C-35),25.7 (C-39),25.2 (C-21),27.9 (C-19),28.8 (C-24),28.9 (C-25),29.9 (C-26),42.2 (C-20),46.9 (C-11),47.8 (C-Ala),48.9 (C-22),5.23 (C-Ala),53.4 (C-23),83.6 (C-2),84 (C-13),90.9 (C-14),100.39 (C-7),102.7 (C-5),107.7 (C-17),115.7 (C-4),123.6 (C-32),124(C-37),126.3 (C-3),121.9 (C-28),131.8 (C-38),131.9 (C-33),133 (C-9),134 (C-10),135 (C-27),157.4 (C-16),157.6 (C-6),161.6 (C-18),173.4 (C-30),178.9 (C-8),204 (C-12);ESI-MS (m/z):714.1[M+H]+.

2.4 30-缬氨酸甲酯-藤黄酸衍生物的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率44%.1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:0.89～0.95 (M,6H,Val-H),1.25 (s,3H,19-H),1.28 (s,3H,24-H),1.44 (s,3H,40-H),1.56 (s,3H,35-H),1.64 (s,3H,39-H),1.66 (s,3H,24H),1.70 (s,3H,29-H),1.74 (s,3H,25-H),1.82 (s,3H,34-H),1.99～2.07 (m,2H,36-H),2.31(dd,J=6 Hz,J=12 Hz,1H,21a-H),2.52～2.55(m,1H,22-H),2.57～2.66 (m,1H,32-H),3.18～3.29 (m,1H,31b-H),3.43～3.51 (m,1H,11-H),3.70(m,3H,Val-OMe),4.40～4.51(m,1H,Ala-OMe),5.02～5.13 (m,1H,37-H),5.02～5.13 (m,1H,3-H),5.43～5.45 (m,1H,32-H),5.45～5.47 (m,1H,4-H),6.67(d,J=12 Hz,1H,4-H),6.64～6.83 (m,1H,27-H),7.56 (d,J=8 Hz,1H,10-H),8.0 (s,1H,NH),12.89 (s,1H,6-OH);13C NMR (CDCl3,100 MHZ)δ:17.6 (C-34),17.7 (C-Ala),18.1 (C-40),21 (C-31),22.6(C-36),25.6(C-35),25.7(C-39),25.2 (C-21),27.9(C-19),28.8(C-24),28.9(C-25),29.9(C-26),42.2(C-20),46.9(C-11),47.8(C-Ala),48.9(C-22),52.3(C-Ala),53.4(C-23),83.6(C-2),84(C-13),90.9(C-14),100.39(C-7),102.7(C-5),107.7(C-17),115.7(C-4),123.6(C-32),124.8(C-37),126.3(C-3),121.9(C-28),131.8(C-38),131.9(C-33),133(C-9),134(C-10),135(C-27),157.4 (C-16),157.6 (C-6),161.6 (C-18),172 (C-30),178.9(C-8),205 (C-12);ESI-MS(m/z):742.1[M+H]+.

2.5 30-异亮氨酸甲酯-藤黄酸衍生物的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率38%.1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:0.90 (t,3H,Ile-CH3),1.10～1.26(m,3H,Ile-CH3),1.27(s,3H,19-H),1.30～1.43(m,3H,24-H),1.45 (s,3H,40-H),1.55(s,3H,35-H),1.69 (s,3H,29-H),1.74(s,3H,25-H),1.80(s,3H,34-H),1.98～2.07(m,2H,36-H),2.28～2.34(dd,J=4.0 Hz,J=13.6 Hz,1H,21a-H),2.54(d,J=7.2 Hz,1H,22-H),2.56～2.64(m,1H,32-H),3.23～3.32(m,2H,31-H),3.45～3.48(m,1H,11-H),3.69(s,3H,Ile-OMe),4.50(dd,J=4.4 HzJ=7.6 Hz,1H,Ile-OMe),5.0～5.08(m,1H,3-H),6.67(d,J=10.4 Hz,1H,4-H),6.76(d,J=12Hz,1H,27-H),7.56(d,J=7.2 Hz,1H,10-H);13C NMR(CDCl3,100 MHZ)δ:11.5 (C-Ile),15.7 (C-Ile),17.6(C-34),18.2(C-40),21.2(C-31),22.7(C-36),25.6(C-35),25.7(C-39),25.2(C-21),27.9(C-19),28.8(C-24),28.9(C-25),29.9(C-26),37.4(C-Gly),42.2(C-20),46.9(C-11),48.9(C-22),52.3(C-Ile),56.4(C-23),83.2(C-2),83.8(C-13),90.9(C-14),100.53(C-7),102.7(C-5),107.7(C-17),115.7(C-4),122.1(C-28),123.6(C-32),124.8(C-37),125.4(C-3),131.7(C-38),131.9(C-33),132.7(C-9),134.2(C-10),136.2(C-27),157.4(C-16),157.6(C-6),161.6(C-18),172(C-30),178.9(C-8),205.5(C-12);ESI-MS m/z:756.[M+H]+

2.6 30-苯丙氨酸甲酯-藤黄酸衍生物的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率29%.1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:1.32～1.36 (m,3H,24-H),1.38～1.44 (m,3H,40-H),1.55 (s,3H,35-H),1.69 (s,3H,29-H),1.66～1.72 (m,3H,25-H),1.74 (s,3H,34-H),2.01～2.04 (m,2H,36-H),2.26～2.40 (m,1H,21a-H),2.57～2.69 (m,1H,22-H),2.66～2.75 (m,1H,32-H),3.07～3.27 (m,2H,31-H),3.49 (s,3H,Phe-OMe),3.7～3.76 (m,2H,Phe-CH2),3.98 (s,1H,Phe-OMe),5.0～5.08 (m,1H,37-H),6.62～6.69 (m,1H,4-H),6.77～6.83 (m,1H,27-H),7.04～7.24 (m,5H,Phe),7.49～7.58 (m,1H,10-H),8.0 (s,1H,NH),12.7～12.8 (m,1H,6-OH);13C NMR (CDCl3,100 MHZ)δ:17.6 (C-34),18.1 (C-40),20.8 (C-31),22.7 (C-36),25.6 (C-35),25.7 (C-39),27.2 (C-19),28.4 (C-24),29.3 (C-25),29.8 (C-26),39.7 (C-Phe),41.7 (C-20),46.8 (C-11),49.0 (C-22),51.2 (C-Phe),52.5 (C-Phe),55.3 (C-23),82 (C-2),88.9 (C-14),108.6 (C-17),115.7 (C-4),123.8 (C-32),127.3 (C-Phe),128.9 (C-37),129.3 (C-Phe),132 (C-33),136 (C-27),155.8 (C-16),157.5 (C-6),161.3 (C-18),173.7 (C-30);ESI-MS (m/z):790.2[M+H]+.

2.7 30-丝氨酸甲酯-藤黄酸的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率32%.1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ:1.27(s,3H,19-H),1.34 (s,3H,24-H),1.45(s,3H,40-H),1.54(s,3H,35-H),1.58(s,3H,29-H),1.65(s,3H,25-H),1.90～1.98(m,2H,36-H),2.23～2.28(dd,J=5.4 Hz,J=12 Hz,1H,21a-H),2.51 (d,J=9.24 Hz,1H,22-H),2.73～2.81 (m,1H,32-H),3.10～3.16(m,1H,31b-H),3.23～3.29(m,1H,31a-H),3.59～3.66 (m,1H,Ser-H),3.74(s,3H,Ser-H),3.79(dd,1H,J=12 Hz,J=3 Hz,Ser-OMe),3.84～3.80 (m,1H,Ser-OMe),5.4(d,J=12 Hz,1H,4-H),6.87～5.92(m,1H,27-H),7.47(d,J=6.6 Hz,1H,10-H);13C NMR (CDCl3,150 MHZ)δ:17.4(C-34),17.9(C-40),20.7(C-39),22.4(C-31),22.6(C-36),24.7(C-35),25.3(C-21),25.5(C-39),27.1(C-19),28.8(C-24),29.2(C-25),29.5(C-26),42.1(C-20),46.7(C-11),49.1(C-22),52.2(C-Ser),59.9(C-23),83.4(C-2),83.8(C-13),91.1(C-14),100.2(C-7),102.6(C-5),107.7(C-17),115.7(C-4),123.5(C-32),124.7(C-37),126.43(C-3),131.6 (C-38),131.8(C-33),132.8(C-9),133.9(C-10),135.4(C-27),157.4(C-16),161.5(C-18),178.7(C-8);ESI-MS (m/z):730.1[M+H]+.

2.8 30-酪氨酸甲酯-藤黄酸的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率36%.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:1.29(s,3H,19-H),1.34(s,3H,24-H),1.37～1.44(s,3H,40-H),1.54(s,3H,35-H),1.62(s,3H,39-H),1.65(s,3H,24H),1.71(s,3H,29-H),1.73(s,3H,25-H),1.86(s,3H,34-H),1.99～2.06(m,2H,36-H),2.31(dd,J=4 Hz,J=14.8 Hz,1H,21a-H),2.54(d,J=9.6 Hz,1H,22-H),2.77～2.86(m,1H,32-H),2.87～2.95(m,2H,26-H),3.12～3.24(m,1H,31b-H),3.25～3.36(m,1H,31a-H),3.43～3.47(m,1H,11-H),3,49(s,2H,Tyr-OMe),3.73(m,3H,Tyr-OMe),4.98～5.12 (m,1H,37-H),4.98～5.12(m,1H,3-H),6.33(t,1H,32-H),6.61～6.66(m,1H,4-H),6.75～6.87(m,2H,Tyr-OMe),6.92～7.07(m,1H,27-H),7.11～7.22(m,2H,Tyr-OMe),7.51(d,J=7.6 Hz,1H,10-H),8.0(s,1H,NH),12.83(s,1H,6-OH);13C NMR (CDCl3,100 MHZ)δ:17.6 (C-34),18.1(C-40),21(C-31),22.6 (C-36),25.6(C-35),25.7(C-39),25.2(C-21),27.9(C-19),28.8(C-24),28.9(C-25),29.9(C-26),42.0(C-20),46.8(C-11),49.0(C-22),50.9(C-Tyr),52.1(C-Tyr),55.8(C-23),83.4(C-2),83.8(C-13),91.1(C-14),100.46(C-7),102.6 (C-5),107.7 (C-17),115.9(C-4),121.6(C-32),122.2(C-Tyr),124.5(C-37),130(C-Tyr),131.6(C-38),131.8(C-33),133.4(C-9),134.4(C-10),135.4(C-27),149.5(C-Tyr),157.5(C-16),157.6(C-6),161.6(C-18),175.2(C-30),178.9(C-8),203.6(C-12);ESI-MS(m/z):806.1[M+H]+.

2.9 30-色氨酸甲酯-藤黄酸的合成

操作同2.2，产物为黄色固体，产率55%.1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:1.26(s,3H,19-H),1.28～1.38(m,3H,24-H),1.42(s,3H,40-H),1.55(s,3H,35-H),1.62(s,3H,29-H),1.65(s,3H,25-H),1.72(s,3H,34-H),1.97～2.06(m,2H,36-H),2.17～2.29(m,1H,21a-H),2.39～2.50(m,1H,22-H),2.60～2.71(m,1H,32-H),3.14～3.24(m,1H,31b-H),3.24～3.33(m,1H,31a-H),3.14-3.33(m.2H,Trp-OMe),3.49(s,1H,11-H),3.64(s,3H,Trp-OMe),5.01～5.08(m,1H,37-H),6.66(d,J=10 Hz,1H,4-H),6.77～6.95(m,1H,27-H),7.0～1.5(m,5H,Trp-OMe),7.5～7.61(m,1H,10-H),8.0(s,1H,NH),12.86(s,1H,6-OH);13C NMR(CDCl3,100 MHZ)δ:17.6(C-34),18.2(C-40),18.3(C-39),21(C-31),22.8(C-36),25.8(C-35),25.2(C-21),27.9(C-19),28.8(C-24),28.9(C-25),29.9(C-26),42.2(C-20),46.9(C-11),48.9(C-22),5.23(C-Trp),58.4(C-23),83.6(C-2),84(C-13),91(C-14),100.7(C-7),102.9(C-5),107.8(C-17),111.3(C-Trp),116.0(C-4),118.8(C-Trp),119.5(C-Trp),121.9(C-28),122.3(C-Trp),122.9(C-Trp),123.9(C-32),124.8(C-37),126.6(C-3),127.6(C-Trp),131.8(C-38),131.9(C-33),132.7(C-9),133.7(C-10),136.2(C-27),157.4(C-16),157.6(C-6),161.6(C-18),172.2(C-30),204.5(C-12);ESI-MS(m/z):829.2[M+H]+.

2.10 30-赖氨酸-藤黄酸衍生物的合成

取 0.25 g 二氯树脂，加入 2 mL CH2Cl2浸泡 0.5 h 进行活化，过滤并用 2 mL DMF 洗涤3次.加入 100 mg保护氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH与 0.5 mL DIEA，加入 2 mL DMF 作为溶剂常温反应 2 h，过滤收集固体，之后加入 0.5 mL 哌啶与 1.5 mL DMF 反应 0.5 h，再次过滤，洗涤并收集固体，加入 50 mg 藤黄酸，40 mg HBTU，0.5 mL DIEA，常温反应 2 h，过滤后向固体中加入含25% 三氟乙酸的DCM，常温反应 4 h，过滤收集滤液，浓缩后葡聚糖凝胶柱层析分离产物，得到黄色固体，产率49%.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:1.28(s,3H,19-H),1.30～1.43(m,3H,24-H),1.44(s,3H,40-H),1.54(s,3H,35-H),1.56(s,2H,Lys-NH2),1.57(s,2H,Lys),1.60(s,3H,39-H),1.62～1.64 (m,3H,24H),1.67(s,3H,29-H),1.68(s,3H,25-H),1.73～1.82(m,2H,36-H),2.26～2.27(m,1H,21a-H),2.50～2.55(m,1H,22-H),2.50～2.55(m,2H,Lys),2.79～2.83(m,1H,32-H),2.89～2.95(m,2H,26-H),3.13～3.19(m,2H,31-H),3.35～3.38(m,1H,11-H),4.96～5.04(m,1H,37-H),4.96～5.04(m,1H,3-H),6.55(dd,J=4.2 Hz,J=10.8 1H,4-H),7.46～7.49(m,1H,10-H);13C NMR(CDCl3,150 MHZ)δ:17.0(C-34),19.7(C-40),21.4(C-31),21.6(C-36),22.4(Lys-C),24.4(C-39),24.6(C-21),27.4(C-19),28.7(C-24),28.9(C-25),29.1(Lys),32.7(Lys-C1),41.8(C-20),48.8(C-22),83.3(C-2),83.8(C-13),90.9(C-14),100.2(C-7),102.4(C-5),107.4(C-17),115.4(C-4),123.6(C-32),124.7(C-37),131.8(C-38),131.3(C-33),133(C-9),136.4 (C-27),157.2(C-16),157.7(C-6),161.5(C-18),171.9(C-30),179.6(C-8);ESI-MS(m/z):757.1[M+H]+.

2.11 30-组氨酸-藤黄酸的合成

操作同2.10，产物为黄色固体，产率28%.1H NMR(CDCl3,600 MHz)δ:1.33(s,3H,19-H),1.30～1.43(m,3H,24-H),1.44(s,3H,40-H),1.53(s,3H,35-H),1.57(s,3H,29-H),1.64(s,3H,25-H),1.69(s,3H,34-H),1.88～1.96(m,2H,36-H),2.22～2.26(dd,J=4.2 Hz,J=13.2 Hz,1H,21a-H),2.47～2.51(m,1H,22-H),2.72～2.78(m,1H,32-H),2.83～2.93 (m,2H,26-H),3.07～3.12(m,1H,His-C1),3.22～3.28(m,1H,31b-H),3.33～3.38 (m,1H,31a-H),3.42～3.47(m,1H,11-H),3.90～3.96(m,1H,His-C),4.93～4.99(m,1H,37-H),5.39(d,J=10.8 Hz,1H,32-H),5.89(t,1H,32-H),6.52(d,J=10 Hz,1H,4-H),7.42～7.47(m,1H,10-H),7.79(s,1H,NH),8.61～8.71(m,1H,His-C),12.86(s,1H,6-OH);13C NMR (CDCl3,150 MHZ)δ:17.6(C-34),18.1(C-40),20.9(C-31),22.8(C-36),25.2(C-21),25.7(C-39),27.8(C-19),28.9(C-25),29.9(C-26),42.2(C-20),46.9(C-11),48.9(C-22),83.6 (C-2),84(C-13),90.9(C-14),102.7(C-5),107.7(C-17),115.7(C-4),123.6(C-32),124.8(C-37),125.3(C-3),121.9(C-28),131.6(C-38),131.9(C-33),133.3(C-9),134.6(C-10),135.4(C-27),137.4(C-His),157.4(C-16),157.5(C-6),161.1(C-18),168.2(C-30),179.2(C-8),203.7(C-12);ESI-MS (m/z):766.1 [M+H]+.

2.12 活性检测

用sulfurhodamine B(SRB)法检测合成所得化合物对4种人源肿瘤细胞株(人肺癌细胞A549，人黑色素瘤细胞 A375，人肝癌细胞 HepG2，人胃癌细胞 BGC823)的体外抗肿瘤活性，并以藤黄酸为对照化合物.结果表明，所有修饰后的衍生物针对不同的细胞系表现出了不同的抗癌活性，并且在针对于特定细胞系时，抗癌活性均获得了保持(表1).

表1 不同化合物对4种肿瘤细胞株的半数抑制浓度(IC50) (μmol·L-1)

1)细胞培养 A549、A375、BGC823和HeGP2 细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养在37 ℃，含5%CO2的细胞培养箱内.

2)细胞细胞毒性(SRB)实验 细胞铺入96孔板，分别设定空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组，每个样品设置至少3个复孔.培养 24 h后，分别加入梯度稀释的样品，继续培养 48 h，之后加入50% 三氯乙酸溶液固定 1 h.弃固定液、洗板、晾干之后加入含1%醋酸的0.4% SRB染色液.洗板、晾干之后加入10 mmol/L Tris溶液溶解染料，在 515 nm 波长下检测其吸光度并计算样品对细胞生长的抑制作用.

3 结果与讨论

20种常用氨基酸中选择了10种有代表性的氨基酸来进行反应，分别包括非极性氨基酸，水溶性性氨基酸和碱性氨基酸.在使用含硫氨基酸进行反应时发现其产物并不稳定，所以没有对含硫氨基酸的衍生物进行检测.同时在合成含胍基的精氨酸-藤黄酸衍生物与酸性氨基酸-藤黄酸衍生物过程中，产生了大量的副产物.故我们没有对这两类氨基酸衍生物进行合成与研究，只选取了10种氨基酸进行反应.

在合成极性氨基酸衍生物11、12时借助了多肽合成思路，利用二氯树脂作为氨基酸C端的保护基减少了副产物，同时得到具有暴露的极性基团的产物.由于中间产物全部连接在树脂上，只需过滤即可去除杂质，也可以方便地使用茚三酮显色反应来监测反应进程.使用硅胶柱层析对非极性氨基酸衍生物进行纯化，在纯化11、12、13时，发现较为严重的吸附与拖尾，产品损失过大同时难以得到纯品，所以改用葡聚糖凝胶柱，利用产物与杂质分子质量的不同进行分离，去除了吸附的效果，得到了纯度较好的产物.

如表1所示，在合成的多种藤黄酸-氨基酸衍生物中，发现含有非极性侧链的衍生物活性较好，如化合物2、3、4，它们显示出比藤黄酸对照品更低的半数抑制浓度，表明合成的这几种衍生物具有更强的体外抗癌活性.同时较小的侧链对生物活性保持更有利，推测原因可能是由于非极性侧链与细胞融合更好，更易透过细胞膜，同时也减缓其代谢速率，保证其作用时间.含有共轭基团与极性基团的衍生物活性降低，如7～12，其针对几种癌细胞的体外细胞毒活性较之藤黄酸对照品，均有不同程度的下降.此外，修饰后的衍生物对于不同的细胞，其活性表现出了明显的差异性，在针对A375与HepG2 2种细胞株的活性测试中，衍生物均体现了较好的生物活性，而针对BGC823细胞株的活性则有下降.而在针对A549细胞株的测试中，具有极性基团的衍生物普遍活性下降，其IC50大多提高10倍以上，这表明这一类衍生物针对A549细胞株的细胞毒活性几乎完全丧失.藤黄酸衍生物在针对不同细胞系表现出不同作用强度的现象值得我们继续深入研究.